氧自由基清除劑對(duì)急性肺損傷大鼠核因子-κB的作用及機(jī)制研究

氧自由基清除劑對(duì)急性肺損傷大鼠核因子—κB的作用及機(jī)制研究目的探討氧自由基清除劑依達(dá)拉奉對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠核因子-κB（NF-κB）的作用及機(jī)制。方法將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組（n=10）：對(duì)照組（A組）、模型組（B組）、依達(dá)拉奉組（C組）。B、C組大鼠腹腔注射脂多糖5mg/kg進(jìn)行造模，A組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液5mg/kg進(jìn)行對(duì)照。造模后C組大鼠腹腔注射依達(dá)拉奉10ml/kg進(jìn)行干預(yù)，A、B組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液10ml/kg進(jìn)行對(duì)照。6h后處死大鼠，抽取腹主動(dòng)脈血液行血?dú)夥治鰷y(cè)定血氧分壓（PO2），用免疫組織化學(xué)法測(cè)定肺組織中NF-κB的含量，用ELISA測(cè)定TNF-α的含量。結(jié)果B、C組大鼠PO2低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組大鼠PO2的下降幅度小于B組，與B組相比，C組的PO2高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C組大鼠NF-κB、TNF-α高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組大鼠NF-κB、TNF-α的上升幅度小于B組，與B組相比，C組的NF-κB、TNF-α低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論依達(dá)拉奉對(duì)脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織起保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制肺組織NF-κB的表達(dá)從而抑制肺部炎癥反應(yīng)有關(guān)。標(biāo)簽：自由基清除劑；急性肺損傷；核因子-κB急性肺損傷（acutelunginjury，ALI）的臨床特征為急性、進(jìn)行性加重的呼吸困難、頑固性低氧血癥和肺水腫。肺炎、胃食管反流、大量輸血、休克、急性胰腺炎等疾病均可導(dǎo)致ALI的發(fā)生，并產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。ALI的機(jī)制有很多，其中核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）參與許多細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并起重要作用[1]。有研究表明NF-κB的活化參與了ALI的發(fā)病過(guò)程[2]。依達(dá)拉奉是一種新型的抗氧化劑和自由基清除劑，可以通過(guò)清除自由基抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化[3]。依達(dá)拉奉作為臨床上常用的氧自由基，是否可以通過(guò)對(duì)NF-κB的抑制達(dá)到緩解ALI癥狀的作用，本研究對(duì)此進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料2012年11月～2013年1月，取雄性大鼠30只，體重200～300g，由長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為3組（n=10）：對(duì)照組（A組）、模型組（B組）、依達(dá)拉奉組（C組）。NF-κB（批號(hào)：bs-5660R）、TNF-α（批號(hào)：EK-0526）試劑盒及相應(yīng)二抗均購(gòu)于北京博奧森公司。脂多糖（批號(hào)：L2880）購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司，依達(dá)拉奉（批號(hào)：H20051992）購(gòu)于吉林博大制藥公司。1.2造模方法首先，B、C組大鼠參照李立斌等[4]、陳曉光等[5]的建模方法，以腹腔注射脂多糖的方式造模。B、C組大鼠腹腔注射脂多糖5mg/kg進(jìn)行造模，A組大鼠為空白對(duì)照組，以腹腔注射0.9%氯化鈉注射液5mg/kg進(jìn)行對(duì)照。造模后C組大鼠腹腔注射依達(dá)拉奉10ml/kg進(jìn)行干預(yù)，A、B組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液10ml/kg進(jìn)行對(duì)照。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1動(dòng)脈血氧分壓PO2測(cè)定各組造模完成后6h處死大鼠，抽取腹主動(dòng)脈血液1ml，測(cè)定PO2。1.3.2肺組織病理檢查取大鼠肺組織進(jìn)行光鏡檢查。1.3.3血漿TNF-α測(cè)定處死大鼠，抽取腹主動(dòng)脈血液5～6ml，4℃離心（3000r/min，10min）后取上清液，置-70℃保存。用ELISA測(cè)定TNF-α的含量。1.3.4NF-κB的測(cè)定處死大鼠后，取右上肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛浸泡組織，4℃冷藏過(guò)夜后，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋切片，行免疫組化法測(cè)定肺組織中NF-κB。使用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值，抗體表達(dá)在肺組織的細(xì)胞質(zhì)或核膜棕黃色染色為陽(yáng)性信號(hào)，細(xì)胞質(zhì)和核膜藍(lán)染為不染色。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1肺組織病理觀察的結(jié)果與A組大鼠相比，B、C組大鼠肺組織明顯肺泡出血、水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但是C組大鼠肺組織出血、水腫較B組輕，炎癥細(xì)胞較B組少。2.2PO2、NF-κB、TNF-α數(shù)據(jù)的結(jié)果B、C組大鼠PO2低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組大鼠PO2的下降幅度小于B組，與B組相比，C組的PO2高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B、C組大鼠NF-κB、TNF-α高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組大鼠NF-κB、TNF-α的上升幅度小于B組，與B組相比，C組的NF-κB、TNF-α低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。3討論NF-κB是一類能與多種基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的總稱。NF-κB是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)[6]，它通過(guò)調(diào)控許多重要的細(xì)胞因子，黏附分子和趨化因子的基因表達(dá)，而參與機(jī)體的各種免疫及炎癥反應(yīng)[7]。同時(shí)，在ALI中炎癥介質(zhì)造成肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，使肺微血管通透性增高，血漿蛋白質(zhì)滲入肺間質(zhì)，造成肺間質(zhì)水腫。炎性細(xì)胞在趨化因子和黏附分子的作用下，移行入肺間質(zhì)，繼續(xù)釋放炎癥介質(zhì)，最終造成肺泡上皮的損傷，氣-血交換屏障破壞，肺水腫和肺組織炎癥呈進(jìn)行性加重。有研究表明[8-9]，NF-κB是炎癥介質(zhì)的上游調(diào)控基因，在ALI發(fā)病過(guò)程中起重要作用。所以，如果抑制了NF-κB的表達(dá)，是否能達(dá)到緩解ALI的癥狀，這就是本課題研究的方向。通過(guò)A、B組的PO2比較，可以看出B組大鼠的PO2較A組降低明顯。同時(shí)結(jié)合病理切片可以看出，B組大鼠的肺損傷明顯。張劍鋒等[10]、田巍等[11]實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)毒素誘發(fā)ALI大鼠NF-κB顯著升高，同時(shí)伴有炎性因子的過(guò)度表達(dá)。所以，通過(guò)A、B組的比較，證明本實(shí)驗(yàn)腹腔注射脂多糖成功建立ALI大鼠模型。C組大鼠造模后腹腔注射依達(dá)拉奉進(jìn)行干預(yù)，C組大鼠PO2的下降幅度小于B組，與B組相比，C組的PO2高。雖然C組也進(jìn)行了造模，但是經(jīng)過(guò)依達(dá)拉奉的干預(yù)后，C組大鼠的PO2較B組明顯好轉(zhuǎn)，說(shuō)明依達(dá)拉奉達(dá)到了緩解大鼠PO2的作用。C組大鼠NF-κB、TNF-α的上升幅度小于B組，與B組相比，C組的NF-κB、TNF-α低，同樣說(shuō)明在經(jīng)過(guò)腹腔注射依達(dá)拉奉后，NF-κB的表達(dá)減少，促炎因子TNF-α的含量也減少，而TNF-α的含量改變可反映其他炎癥因子的改變情況[12]。上述數(shù)據(jù)說(shuō)明，依達(dá)拉奉能緩解ALI癥狀，減少炎性因子的表達(dá)。對(duì)ALI的治療中，阻斷炎癥介質(zhì)的瀑布式反應(yīng)可能成為治療ALI的新靶點(diǎn)[13]。有研究表明，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可以有效抑制NF-κB的活化[14-15]。而作為臨床工作中常用的氧自由基清除劑依達(dá)拉奉，通過(guò)本研究證明其對(duì)脂多糖所致的ALI大鼠肺組織起保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制肺組織NF-κB的表達(dá)從而抑制肺部炎癥反應(yīng)有關(guān)。[參考文獻(xiàn)][1]AbrahamE.NF-κBactivation[J].CritCareMed，2000，28（1）：100-104.[2]SchwartzMD，MooreEE，MooreEA.Nuclearfactor-κBisactivatedinalveolarmacrophagesfrompatientswithacuterespiratorydistresssyndrome[J].CritCareMed，1996，24：1285-1292.[3]刁學(xué)軍.依達(dá)拉奉治療急性腦梗死臨床療效觀察[J].中國(guó)基層醫(yī)藥，2012，19（20）：3092-3093.[4]李立斌，方強(qiáng)，李利.脂多糖誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷時(shí)核因子-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及鹽酸氨溴索的作用[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2007，16（7）：694-698.[5]陳曉光，白濤，吳濱陽(yáng)，等.谷氨酰胺對(duì)脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織核因子-κB的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88（23）：1648-1650.[6]邱海波，楊毅，周韶霞，等.核因子-κB在小鼠急性肺損傷中的作用[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2003，12（1）：15-17.[7]謝艷萍，王建春.核因子-κB與急性肺損傷[J].重慶醫(yī)學(xué)，2003，32（1）：115-117.[8]WanF，LenardoMJ.ThenuclearsignalingofNF-kappaB：currentknowledge，newinsights，andfutureperspectives[J].CellRes，2010，20（1）：24-33.[9]LiuG，ParkYJ，TsurutaY，etal.p53attenuateslipopolysaccharide-inducedNF-kappaBactivationandacutelunginjury[J].JImmunol，2009，182（8）：5063-5071.[10]張劍鋒，李超乾，磨靜佳，等.甘草酸二銨對(duì)急性肺損傷大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