蛋白質(zhì)的測定作業(yè)指導(dǎo)書

蛋白質(zhì)的測定作業(yè)指導(dǎo)書1.1開氏法測定粗蛋白質(zhì)適用范圍本法適于谷物及油料作物種子中粗蛋白質(zhì)測定，是農(nóng)牧漁業(yè)部部頒標準法，即用開氏法測總氮量，再乘以蛋白質(zhì)換算因數(shù)，而得粗蛋白質(zhì)含量。試劑配制(1)1/2

0.2mol/L硫酸標準液(此濃度適用于谷類作物種子)或1/20.05mol/L硫酸標準液(此濃度適用于大豆種子)。(2)濃硫酸(3)混合催化劑：稱取硫酸鉀(或硫酸鈉)100g，硫酸銅10g，均勻混合后研細(通過0177mm孔徑)，貯于瓶中。(4)蔗糖(分析純)測定步驟

將選有代表性種子，按四分法取樣后，置60℃烘箱中干燥，用粉碎機磨碎，通過0.05mm孔徑，置磨口廣口瓶中保存。稱樣0.5000—0.1000g，放入100ml開氏瓶中，放入2—4g混合催化劑和5—8ml濃硫酸，混勻放置過夜。將開氏瓶傾斜置于電爐上，開始用小火加熱，待泡沫停止后加大火力，保持開氏瓶中液體連續(xù)沸騰，沸騰的酸應(yīng)在開氏瓶頸中部冷凝回流，待消煮液無微小碳粒并呈透明的淺綠色時，繼續(xù)消煮30min(含蛋白質(zhì)高的樣品，如豆類，需煮60min)。待消煮液稍冷卻后，無損地移入100ml容量瓶中，多次用水洗滌，冷卻后定容。放置澄清。用移液管吸取待測液5.00或10.00ml(含NH4+—N約1mg)，放入半微量定氮蒸餾裝置中，加入約5ml40%的氫氧化鈉進行蒸餾。按同樣條件，稱0.1g蔗糖代替樣品做空白試驗。結(jié)果計算粗蛋白質(zhì)%=[SX()(V-V0)×0.014×分取倍數(shù)〖〗W(1-水分率)〖SX〗]×K×100

式中：V—滴定樣品時所用標準酸的毫升數(shù)；V0—空白測定所用酸的毫升數(shù)；M—標準酸的摩爾濃度；0．014—氮的毫摩爾質(zhì)量g/mmol；取用量倍數(shù)—本操作步驟中為100/5或100/10，即為20或10；W—稱樣重(g)；K—蛋白質(zhì)的換算因數(shù)。一般情況下為6.25，這是由蛋白質(zhì)平均含氮量為16%計算而得，即100/16=6.25。但由于各種作物蛋白質(zhì)中含氮量不同，其換算因數(shù)也各不相同。各類作物蛋白質(zhì)換算因數(shù)，可見表各類作物的蛋白質(zhì)換算因數(shù)作物（種子）蛋白質(zhì)換算因數(shù)麥類、雜豆類水稻高粱玉米、大豆及其他谷類作物5.705.955.836.251.2銅鹽沉淀法測純蛋白質(zhì)

本法測定的含氮物質(zhì)不包括非蛋白質(zhì)物質(zhì)。因此通過蛋白質(zhì)換算因數(shù)而得到的是純蛋白質(zhì)%。試劑配制(1)

6%硫酸銅60gCuSO4·5H2O溶于1L水中。(2)

1.25%氫氧化鈉

12.5gNaOH溶于1L水中。(3)

濃硫酸(4)

混合催化劑

稱取硫酸鉀(或硫酸鈉)100g,硫酸銅10g，均勻混合后研細(通過0.177mm孔徑)，貯于瓶中。(5)

0.025—0.05mol/L硫酸標準液(6)

0.005—0.01mol/L硫酸標準液測定步驟稱取1.000—2.000g經(jīng)過0.42mm孔徑的風干樣品，于150ml燒杯中加約50ml熱水，放入40—50℃的水浴上加熱10min。燒杯內(nèi)物質(zhì)還未冷時，隨即加25ml16%硫酸銅溶液，然后一邊攪拌，一邊緩緩注入25ml1.25%氫氧化鈉溶液。如此形成的堿式硫酸銅［CuSO4·Cu(OH)2］將使樣品中的蛋白質(zhì)沉淀?？捎檬镌嚰堅跓袡z查，溶液不應(yīng)是堿性反應(yīng)。因為堿性反應(yīng)會引起凝結(jié)的蛋白質(zhì)溶解。放置0.5—1h(也可放置過夜)，用傾瀉法過濾，即將沉淀上部液體沿玻棒倒到漏斗中，沉淀留在燒杯中用熱水洗幾次，而后將沉淀不損失地移至漏斗上，并繼續(xù)用熱水洗至濾液遇5%氯化鋇不再產(chǎn)生硫酸鋇白色沉淀為止。此時間接指示非蛋白質(zhì)含氮物已被洗凈。將帶有沉淀的漏斗在50—60℃烘干，直到失去大部分水，將濾紙及內(nèi)容物從漏斗上取下，并卷成筒狀，毫無損失地移入250ml開氏瓶中，用量筒加入濃硫酸20—30ml，放置2h或過夜。加入1：10硫酸銅—硫酸鉀5g，傾斜置于電爐上先用小火加熱，逐漸升溫(避免黑色物升于瓶外)，直至出現(xiàn)白色蒸氣后才可加大火力使沸騰，消煮至溶液呈透明的淡綠色，再消煮30min。取下凱氏瓶，冷卻，用蒸餾水將消煮液一起洗入250ml容量瓶中，冷卻至室溫后，用水定容、搖勻。吸取5—10ml待測液用半微量法測氮(含氮約0.5—1mg)。用普通定氮裝置時，可吸取25—50ml(含氮約10—20mg)。測定同時作空白試驗。注釋

所獲蛋白質(zhì)沉淀不必烘至過干，以免沉淀發(fā)脆，塞入開氏瓶時容易損失。只須烘至將濾紙卷成筒狀而無水分滲出即可。表

各種作物收獲物中蛋白質(zhì)的含量范圍(千重%)作物名稱蛋白質(zhì)%(干基)作物名稱蛋白質(zhì)%(鮮基)菜豆洋扁豆豌豆蠶豆大豆亞麻向日葵(種仁)棉花(種仁)花生(種仁)小麥黑麥大麥燕麥稻(種仁)玉米小米(種仁)高梁蕎麥(種仁)15.0—30.524.6—34.124.0—34.027.0—35.029.4—50.42.00—30.821.1—30.228.6—42.019.3—30.014.4—24.18.3—19.410.6—20.48.0—17.37.8—14.59.0—13.210.2—21.59.5—15.312.8—19.0馬鈴薯冬油菜甜菜蘿卜胡蘿卜洋蔥大蒜菠菜芹菜蕃茄茄子辣椒南瓜黃瓜甘藍花椰菜漿果核桃高梁葉高梁莖0.7—2.71.0—1.50.7—