人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范編制說明

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范》（征求意見稿）編制說明標(biāo)準(zhǔn)起草工作組2024年9月一、工作簡況（一）任務(wù)來源根據(jù)2024年全國標(biāo)準(zhǔn)化工作要點，加強質(zhì)量支撐和標(biāo)準(zhǔn)引領(lǐng)，深入推進(jìn)國家標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展綱要各項重點任務(wù)實施，以標(biāo)準(zhǔn)有力引領(lǐng)現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)，推動標(biāo)準(zhǔn)化更好服務(wù)經(jīng)濟(jì)社會高質(zhì)量發(fā)展。依據(jù)《中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法》和《團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理規(guī)定》（國標(biāo)委聯(lián)[2019]1號）的相關(guān)要求，中國食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會批準(zhǔn)立項并聯(lián)合相關(guān)單位共同制定《人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。（二）制定背景隨著再生醫(yī)學(xué)和干細(xì)胞治療技術(shù)的快速發(fā)展，人體肌肉干細(xì)胞作為具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞類型，在治療肌肉損傷、退行性疾病以及促進(jìn)組織修復(fù)等方面展現(xiàn)出巨大的醫(yī)療潛力和市場價值。隨著全球范圍內(nèi)干細(xì)胞技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化的不斷進(jìn)步，以及人口老齡化、慢性病負(fù)擔(dān)加重等社會問題的凸顯，人體肌肉干細(xì)胞治療的市場需求持續(xù)增長。近年來，人體肌肉干細(xì)胞分離制備技術(shù)取得了顯著突破，包括采集方法、分離純化技術(shù)、擴(kuò)增培養(yǎng)條件等方面的優(yōu)化和創(chuàng)新。然而，技術(shù)的快速發(fā)展也帶來了監(jiān)管和標(biāo)準(zhǔn)化的需求。為了確保干細(xì)胞治療的安全性和有效性，各國政府和監(jiān)管機構(gòu)紛紛出臺相關(guān)政策，要求干細(xì)胞產(chǎn)品的制備過程必須遵循嚴(yán)格的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。因此，人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范的制定成為市場發(fā)展的必然趨勢。在市場需求增長和技術(shù)突破的推動下，人體肌肉干細(xì)胞分離制備領(lǐng)域吸引了眾多企業(yè)和研究機構(gòu)的關(guān)注。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有多家企業(yè)和研究機構(gòu)在從事人體肌肉干細(xì)胞的分離制備工作，市場競爭格局逐漸形成。為了搶占市場份額和提升競爭力，各企業(yè)和研究機構(gòu)紛紛加大研發(fā)投入，致力于提升干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量和制備效率。同時，規(guī)范的制定也為市場競爭提供了公平、透明的環(huán)境，有助于促進(jìn)市場的健康發(fā)展。各國政府對干細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展給予了高度重視和支持，紛紛出臺相關(guān)政策文件加強監(jiān)管和審批力度。例如，中國政府將干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)列為國家戰(zhàn)略發(fā)展支柱產(chǎn)業(yè)，并出臺了一系列政策文件加強監(jiān)管和審批力度。這些政策的出臺為人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范的制定提供了有力保障和更多發(fā)展機遇。同時，法規(guī)建設(shè)的不斷完善也為市場參與者提供了明確的指導(dǎo)和規(guī)范框架。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和政策的持續(xù)支持，人體肌肉干細(xì)胞分離制備領(lǐng)域?qū)⒂瓉砀訌V闊的發(fā)展前景。一方面，市場需求的持續(xù)增長將推動該領(lǐng)域的快速發(fā)展；另一方面，規(guī)范的制定和實施將提升干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性，進(jìn)一步拓展市場應(yīng)用空間。未來，人體肌肉干細(xì)胞有望在更多疾病領(lǐng)域得到應(yīng)用并成為常規(guī)治療手段之一，為醫(yī)學(xué)進(jìn)步和人類健康事業(yè)做出重要貢獻(xiàn)。制定《人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范》是干細(xì)胞領(lǐng)域發(fā)展的重要一步，對于保障干細(xì)胞質(zhì)量和安全、促進(jìn)技術(shù)統(tǒng)一與標(biāo)準(zhǔn)化、指導(dǎo)臨床研究與應(yīng)用、保障患者權(quán)益、推動干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)發(fā)展以及促進(jìn)國際合作與交流等方面都具有重要意義。隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，規(guī)范的制定和實施將發(fā)揮越來越重要的作用。（三）起草過程3.1標(biāo)準(zhǔn)研制階段2024年3～6月，起草組通過企業(yè)調(diào)研，了解企業(yè)實際生產(chǎn)情況，并組織收集、整理相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化資料、專業(yè)文獻(xiàn)等，經(jīng)成分分析、研討、論證后編寫完成《人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范》立項申請書及標(biāo)準(zhǔn)框架相關(guān)內(nèi)容，并向中國食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會提出標(biāo)準(zhǔn)立項申請。3.2標(biāo)準(zhǔn)立項階段2024年7月，中國食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會正式發(fā)布了《人體肌肉干細(xì)胞分離制備規(guī)范》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)立項通知，并在全國團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)信息平臺進(jìn)行公示。3.3標(biāo)準(zhǔn)起草階段2024年7月～2024年9月，依據(jù)《中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法》、《國務(wù)院關(guān)于深化標(biāo)準(zhǔn)化工作改革方案》等文件的要求，按照團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的制修訂程序組織有關(guān)技術(shù)人員成立標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，通過相關(guān)信息化手段進(jìn)行多次內(nèi)容討論和交流，并向相關(guān)單位和專家咨詢，在廣泛聽取各方意見和充分論證的基礎(chǔ)上，對標(biāo)準(zhǔn)初稿進(jìn)行了完善和修改后經(jīng)起草組確認(rèn)，同意作為征求意見稿，公開征求意見。二、編制原則在標(biāo)準(zhǔn)制定過程中，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組按照GB/T1.1—2020給出的規(guī)則編寫，主要遵循以下原則：（1）協(xié)調(diào)性:保證標(biāo)準(zhǔn)與國內(nèi)現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。（2）規(guī)范性：嚴(yán)格按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫質(zhì)量。（3）適用性：結(jié)合生產(chǎn)企業(yè)管理實踐和產(chǎn)品的主要環(huán)境影響，提出對企業(yè)產(chǎn)品的具體質(zhì)量要求和生產(chǎn)經(jīng)營規(guī)范。三、主要技術(shù)內(nèi)容及其確定依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了人體肌肉干細(xì)胞的基本要求、樣本采集、樣本運輸、樣本接收、分離與培養(yǎng)、記錄、質(zhì)量控制、質(zhì)量評價與放行。本標(biāo)準(zhǔn)適用于人體肌肉干細(xì)胞的分離制備與質(zhì)量控制。

本標(biāo)準(zhǔn)給出了人體肌肉干細(xì)胞的術(shù)語和定義。將人體肌肉干細(xì)胞定義為從人體肌肉組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。基本要求場地與設(shè)施人體肌肉干細(xì)胞制備機構(gòu)的場地和設(shè)施應(yīng)滿足以下要求：選址應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合GB3095標(biāo)準(zhǔn)分級二級標(biāo)準(zhǔn)；實驗室或廠房應(yīng)由具有潔凈實驗室設(shè)計建設(shè)資質(zhì)的工程公司設(shè)計與建造，并應(yīng)符合GB19489、GB50073、GB50346和GB50591的規(guī)定。建設(shè)完成后，各功能區(qū)域的潔凈級別應(yīng)由專業(yè)機構(gòu)進(jìn)行檢測并出具合格證明；各功能區(qū)應(yīng)按肌肉干細(xì)胞制備工藝進(jìn)行各區(qū)域設(shè)計，符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》的要求。應(yīng)配備獨立質(zhì)量檢測實驗室，并符合GB19489和GB50346的規(guī)定。設(shè)備和耗材人體肌肉干細(xì)胞制備機構(gòu)的設(shè)備和耗材應(yīng)滿足以下要求：應(yīng)優(yōu)先選用符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，獲得國家資質(zhì)認(rèn)證的設(shè)備、儀器、耗材和試劑；應(yīng)對設(shè)備、儀器、耗材和試劑供應(yīng)商進(jìn)行資質(zhì)審核認(rèn)證，要求供應(yīng)商提供產(chǎn)品質(zhì)量報告和批次檢驗報告，并對耗材及試劑進(jìn)行質(zhì)量抽檢，避免采購質(zhì)量不合格的產(chǎn)品；設(shè)備和儀器正式使用前應(yīng)做安裝確認(rèn)(IQ)、運行確認(rèn)（OQ）和性能確認(rèn)(PQ)，并定期進(jìn)行第三方校準(zhǔn)，不得使用有安全隱患的儀器操作樣本及細(xì)胞制品；應(yīng)對設(shè)備與儀器進(jìn)行編號建檔，并建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程(SOP)，確保使用、運行、保養(yǎng)、維修記錄完整可追溯，對于關(guān)鍵工藝相關(guān)設(shè)備參數(shù)應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)測，及時對狀態(tài)異常的設(shè)備進(jìn)行校對和維修。人員管理人體肌肉干細(xì)胞制備機構(gòu)人員管理應(yīng)滿足以下要求：應(yīng)分別設(shè)立干細(xì)胞制備負(fù)責(zé)人、質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人和質(zhì)量授權(quán)人崗位。由法人授權(quán)任命，任職資質(zhì)應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，定期接受崗位專業(yè)培訓(xùn)，制備負(fù)責(zé)人與質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人、質(zhì)量授權(quán)人不得相互兼任；干細(xì)胞制備和質(zhì)量技術(shù)人員應(yīng)具備的健康要求：HAV、HBV、HCV、HIV及梅毒的抗體檢測應(yīng)為陰性，并且(矯正)視力正常，無色盲、色弱；干細(xì)胞制備和質(zhì)量技術(shù)人員應(yīng)半年接受體檢一次，有呼吸道感染或發(fā)熱等疾病狀態(tài)下不得進(jìn)入潔凈操作區(qū)，需完全康復(fù)后方可恢復(fù)崗位操作；干細(xì)胞制備和質(zhì)量技術(shù)人員上崗前應(yīng)經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，內(nèi)容包括但不限于干細(xì)胞理論與實踐、生命倫理、干細(xì)胞法律法規(guī)、GMP管理、GCP資質(zhì)、制劑基本知識、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)、生物安全、儀器設(shè)備使用與維護(hù)方法、物料管理與清潔衛(wèi)生、崗位職責(zé)、操作規(guī)范等內(nèi)容。樣本采集一般要求a）人體肌肉樣本采集與處理應(yīng)符合GB/T37864的要求。采集和處理程序可供樣本采集人員使用。b）人體肌肉樣本采集方應(yīng)具備相關(guān)的資質(zhì)和設(shè)施環(huán)境。c）人體肌肉樣本采集應(yīng)通過倫理審查批準(zhǔn)并履行知情同意程序，應(yīng)建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量管理體系確保符合用戶需求并持續(xù)改進(jìn)。供者健康a）人體肌肉樣本采集方應(yīng)對供者的基本信息與健康信息進(jìn)行詳細(xì)采集與記錄，同時做好對供者的隱私保護(hù)，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。b）供者應(yīng)無血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤史、性傳播疾病及高危人群史、吸毒史，不應(yīng)具有包括但不限于以下疾病或健康狀況：c）一般傳染性疾病或其他遺傳疾?。篐IV、HBV、HCV、梅毒、HTLV、EBV與CMV抗體與核酸檢測應(yīng)為陰性；傳染性皮膚病(未治愈的)；大面積皮膚損傷(未治愈的)；f）鼻/咽喉傳染病(未治愈的)。g）采集前12個小時內(nèi)用過酒精，鎮(zhèn)靜藥等。采集場所人體肌肉的采集場所應(yīng)達(dá)到Ⅲ級潔凈手術(shù)室要求。采集人員采集人員應(yīng)具有醫(yī)師職業(yè)證，且經(jīng)過相應(yīng)的技術(shù)培訓(xùn)。采集流程信息填寫a）采集人員應(yīng)按照要求填寫個人信息，個人信息表應(yīng)包括但不限于：姓名、性別、有效身份證件、聯(lián)系方式、緊急聯(lián)絡(luò)人、住址等。b）采集人員在采集前填寫健康調(diào)查表。采集前準(zhǔn)備肌肉組織采集前應(yīng)由醫(yī)師制定手術(shù)方案和術(shù)前術(shù)后的防感染措施。b）應(yīng)確定供者身體健康，精神狀態(tài)良好，保持供者的血壓、血糖控制在較好的范圍內(nèi)。c）采集前的三天內(nèi)應(yīng)停用抗凝藥、激素、阿司匹林、維生素E等。采集術(shù)前兩天應(yīng)清淡飲食，合理安排作息時間。e）采集前應(yīng)對客戶進(jìn)行身體檢查，包括但不限于：病毒全套、血常規(guī)、凝血系列、心電圖等。耗材器械確認(rèn)采集人員應(yīng)按照采集套裝清單核查器材種類和數(shù)量，一次性使用物品在有效期內(nèi)且包裝完好。手術(shù)前應(yīng)對采集器材進(jìn)行復(fù)核，復(fù)核內(nèi)容主要包括：手術(shù)包：無破損、無滲漏、無污染，處于有效期內(nèi)；消毒劑：一般選用含碘消毒液，對碘過敏者可選用其他消毒劑；應(yīng)處于有效期內(nèi)；應(yīng)標(biāo)明啟用日期；采集容器上均已粘貼供者識別碼。采集過程由醫(yī)師行肌肉切取手術(shù)，置于無菌采集瓶中，密封保存，并粘貼條形碼作為唯一標(biāo)識。采集后注意事項a)采集后盡量平躺休息60分鐘，盡量減少肢體運動。b)采集后一周建議溫水擦浴，傷口不要碰水。c)采集后三天內(nèi)禁止飲酒，飲食以清淡為主。d)保持心情舒暢，合理飲食，作息時間規(guī)律。e)特殊情況（如感染、血腫、疼痛等）及時復(fù)診。樣本運輸一般要求a）樣本運輸人員應(yīng)是經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)合格的人員，對樣本運輸應(yīng)制定規(guī)范及應(yīng)急預(yù)案，并對樣本運輸全程做記錄，包括但不限于運輸?shù)姆绞?、條件、路徑、時間、人員、地址及樣本信息，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。b）樣本運輸應(yīng)采用平穩(wěn)、安全、快速的運輸途徑，宜采用冷藏運輸車或?qū)Ｓ脴?biāo)本冷藏運輸箱運輸。c）運輸過程中應(yīng)防滲漏、防輻射、抗震動、耐壓、耐熱等，樣本包裝應(yīng)貼上條形碼作為唯一標(biāo)識。d）樣本運輸溫度應(yīng)維持在2℃～8℃，運輸時間不超過12小時。運輸箱運輸箱應(yīng)有相應(yīng)的標(biāo)識，標(biāo)識內(nèi)容應(yīng)完整、清晰，標(biāo)識至少包括以下內(nèi)容：——采集方名稱及聯(lián)系方式；——最大承重量；——放置方向、防摔、防曬、防雨標(biāo)識；——最多疊放層數(shù)；——樣本的品名、運輸起始地和目的地、樣本保存溫度；——生物危害標(biāo)識；——禁止輻射標(biāo)識。質(zhì)量監(jiān)控樣本運輸過程中應(yīng)有可供追溯的記錄，記錄應(yīng)包括下列內(nèi)容：品名、數(shù)量、規(guī)格；狀態(tài)是否正常；運輸?shù)氖及l(fā)地和目的地；采集機構(gòu)交接人、時間和日期；運輸承接人、時間和日期；運輸方式和運輸箱編號及溫度狀態(tài)；運輸箱的外觀和標(biāo)識是否完整。運輸前應(yīng)檢查冷藏運輸箱及控溫設(shè)備的性能和運行狀態(tài)是否符合要求。運輸設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)控和評估：溫度：隨機抽取運輸箱進(jìn)行腔體空載和滿載條件下的測定，確認(rèn)其滿足性能要求；微生物：對箱體的內(nèi)壁進(jìn)行取樣開展微生物培養(yǎng)，不得檢出致病性的微生物。運輸過程的記錄應(yīng)放入樣本檔案，保存至樣本使用或銷毀后10年以上。樣本接收a）樣本接收人員應(yīng)是經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)合格的人員，應(yīng)遵從安全與準(zhǔn)確的原則對樣本接收制定規(guī)范及應(yīng)急預(yù)案，并對樣本接收過程進(jìn)行記錄，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。b）樣本接收時，接收人員應(yīng)做好自我防護(hù)工作，接觸樣本之前應(yīng)佩戴手套與口罩，并對接收場所進(jìn)行消毒。c）接收樣本后應(yīng)先觀察樣本容器外包裝的外觀，檢查有無破損。檢查外觀后，工作人員應(yīng)檢查樣本采集信息記錄表是否齊全，同時確認(rèn)記錄表上信息是否填寫完整，檢查信息記錄表信息是否與樣本信息一一對應(yīng)，樣本及記錄表上應(yīng)貼有一致對應(yīng)的條形碼，做到樣本與供者信息相對應(yīng)，確認(rèn)無誤后進(jìn)行接收。d）樣本接收后，使用75%醫(yī)用酒精消毒清理容器外表面，如不能及時對樣本進(jìn)行處理，需把樣本保存在2℃～8℃條件下，最長時間不超過12小時。樣本量應(yīng)能夠滿足制備和檢測的最低要求。樣本接收后應(yīng)及時將信息反饋給樣本發(fā)送方。f）制備機構(gòu)應(yīng)制定樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)，按照樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)處理樣本。分離與培養(yǎng)基本要求a）人體肌肉干細(xì)胞分離與培養(yǎng)應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨慶前研究指導(dǎo)原則》要求的車間內(nèi)進(jìn)行。b）所有操作應(yīng)事先制定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，由經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員嚴(yán)格遵照執(zhí)行，并進(jìn)行記錄登記，相關(guān)記錄入檔保留至少30年。c）分離與培養(yǎng)過程中應(yīng)標(biāo)識干細(xì)胞的名稱、代次、批次、操作日期、培養(yǎng)條件、操作人員姓名等信息。d）所使用試劑應(yīng)采用符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》、《中華人民共和國藥典》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求的藥品輔料或已獲批的藥品，應(yīng)出具產(chǎn)品質(zhì)檢合格報告，并對各批次試劑進(jìn)行質(zhì)量抽檢。e）應(yīng)避免人源或動物源性血清及蛋白，不得使用同種異體人血清或血漿。如必須使用動物血清，應(yīng)確保其無特定動物源性病毒污染。嚴(yán)禁使用海綿體狀腦病流行區(qū)來源的牛血清。分離前準(zhǔn)備工作a）環(huán)境確認(rèn)：潔凈室和潔凈工作臺或生物安全柜應(yīng)使用紫外燈滅菌30分鐘，并啟動凈化風(fēng)機和空調(diào)系統(tǒng)自凈20分鐘以上。b）工作人員核對樣本與采集信息內(nèi)容一致性，用75%的乙醇對采集瓶外表面自下而上進(jìn)行清潔消毒，并放置傳遞窗自凈15分鐘后，傳入分離、處理區(qū)域。c）物料準(zhǔn)備：取出所需的試劑及耗材放置物料推車上，放置于潔凈化工作臺或生物安全柜旁邊，待用。核查確認(rèn)所用試劑及耗材的批號及是否在有效期內(nèi)。d）培養(yǎng)液準(zhǔn)備：自配培養(yǎng)液使用前確認(rèn)微生物培養(yǎng)72小時以上結(jié)果為陰性；商品化的細(xì)胞培養(yǎng)液使用前應(yīng)核查確認(rèn)合格證和有效期。分離與培養(yǎng)方法將肌肉組織剪碎至糜狀，以膠原酶、中性酶和胰酶消化法分離原代細(xì)胞，采用貼壁法（膠原蛋白包埋的培養(yǎng)板）進(jìn)行人肌肉間充質(zhì)干細(xì)胞（鐵壁快，24小時之內(nèi)）和肌肉干細(xì)胞（貼壁慢，48小時之后)的分離。細(xì)胞換液a）換液操作應(yīng)嚴(yán)格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無外源微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄并入檔保存至少30年。b）換液時間及頻次應(yīng)根據(jù)肌肉干細(xì)胞生長情況及培養(yǎng)基狀態(tài)進(jìn)行判斷，以保障肌肉干組胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)水平，并消除代謝物毒害作用。c）換液操作時吸棄培養(yǎng)瓶中原有的部分或全部培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液。首次換液需要在鏡下觀察到原代細(xì)胞完全貼壁和延展后方可進(jìn)行。d）培養(yǎng)基成分應(yīng)符合肌肉干細(xì)胞分離與培養(yǎng)基本要求，盡量采用已獲國家批準(zhǔn)的臨床級產(chǎn)品或藥品輔料。細(xì)胞傳代a）傳代操作應(yīng)嚴(yán)格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無外源微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄并入檔保存至少30年。b）一般情況在達(dá)到65%～80%融合度可講行傳代操作，傳代操作應(yīng)密度適宜、及時，迅速。c）傳代所使用消化酶應(yīng)符合肌肉干細(xì)胞分離與培養(yǎng)的基本要求，盡量采用國家已批準(zhǔn)的臨床級產(chǎn)品。如必須使用動物源性消化酶，應(yīng)確保其無特定動物源性病毒污染。細(xì)胞凍存a）凍存操作應(yīng)嚴(yán)格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無外源微生物污染，相關(guān)操作均進(jìn)行記錄并入檔保存至少30年。b）經(jīng)制備數(shù)量達(dá)到凍存要求的肌肉干細(xì)胞系可進(jìn)行凍存操作，凍存細(xì)胞應(yīng)加入適當(dāng)?shù)膬龃姹Ｗo(hù)液，遵循程序降溫原則，并在液氮中進(jìn)行保存。c）凍存液成分應(yīng)符合肌肉干細(xì)胞分離與培養(yǎng)的基本要求，盡量采用國家已批準(zhǔn)的臨床級產(chǎn)品或藥品輔料，二甲基亞砜含量不得超過10%，如必須使用動物源性血清，應(yīng)確保其無特定動物源性病毒污染，嚴(yán)禁使用海綿狀腦病流行區(qū)來源的牛血清。d）凍存細(xì)胞應(yīng)標(biāo)明干細(xì)胞名稱、培養(yǎng)條件、代次、批次、操作人員、凍存日期等信息，并具有唯一標(biāo)識。e）液氮凍存應(yīng)使用符合要求的液氮容器，氣相凍存，由專人負(fù)責(zé)，保證液氮充足，溫度恒定。穩(wěn)定性考察a）細(xì)胞庫應(yīng)依據(jù)儲存的干細(xì)胞產(chǎn)品的特性，制定年度的儲存細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定性考察方案和計劃，并制定穩(wěn)定性考察的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。b）穩(wěn)定性考察的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于以下內(nèi)容：凍存容器完整性和密閉性；細(xì)胞活率；微生物培養(yǎng)；細(xì)胞凍存復(fù)蘇回收率；細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)；細(xì)胞生物學(xué)效力。c）肌肉干細(xì)胞在凍存后1周復(fù)蘇存活率不應(yīng)低于80%，1年復(fù)蘇存活率不應(yīng)低于60%。d）常規(guī)每年至少執(zhí)行一次穩(wěn)定性考察計劃，如遇特殊情況（例如液相液氮罐故障）可臨時性增加穩(wěn)定性考察計劃。e）應(yīng)對年度性的穩(wěn)定性考察結(jié)果進(jìn)行趨勢分析，便于監(jiān)測細(xì)胞儲存的連續(xù)穩(wěn)定性并改進(jìn)細(xì)胞儲存工藝。記錄原始記錄應(yīng)確保其可追溯細(xì)胞分離、處理和儲存操作所有環(huán)節(jié)，記錄內(nèi)容包含但不限于以下信息：供者身份號碼；產(chǎn)品描述碼、采集類型和分類碼；產(chǎn)品名稱和組分；供者唯一身份辨識符，如果適用；采集日期和時間；生產(chǎn)制備機構(gòu)的名稱和地址；制備、保存、凍存中關(guān)鍵步驟的細(xì)節(jié)及結(jié)果；關(guān)鍵步驟的日期和時間，如果適用；每一步驟的操作人員姓名；10）在分離、處理、凍存、儲存過程中使用的關(guān)鍵物料的名稱、生產(chǎn)商、批號、有效期限；使用試劑的數(shù)量；12）使用設(shè)備編碼。記錄的審核：應(yīng)對記錄的準(zhǔn)確性和完整性以及標(biāo)準(zhǔn)、法律法規(guī)的符合性進(jìn)行審核。記錄的保存：記錄應(yīng)歸檔于受控區(qū)域進(jìn)行保存，確保整個保存期間記錄的清晰和完整性，并應(yīng)避免意外或非授權(quán)的調(diào)閱、丟失、損壞、破壞、混淆或篡改。記錄的修改：機構(gòu)應(yīng)建立并保持合適的記錄修改程序。記錄修改人的簽名及日期應(yīng)記錄下來；修改前的記錄內(nèi)容應(yīng)清晰可辨認(rèn)。隱私保護(hù)：應(yīng)建立保密機制，確保供者、員工信息的保密性。記錄保存期限：文件記錄是要保存至細(xì)胞應(yīng)用或處理后20年。質(zhì)量控制質(zhì)控內(nèi)容a）人體肌肉干細(xì)胞安全性人體肌肉干細(xì)胞安全性檢驗項目包括：1）無菌檢測：參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1101無菌檢測法執(zhí)行，對肌肉干細(xì)胞樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液等）檢測。細(xì)菌和真菌檢測結(jié)果都應(yīng)為陰性；2）支原體檢測：參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則3301支原體檢測法執(zhí)行，對肌肉干細(xì)胞樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液等）檢測。支原體檢測結(jié)果都應(yīng)為陰性；3)細(xì)胞內(nèi)外源致病因子檢測：采用血清ELISA檢測法或核酸檢測法，對肌肉干細(xì)胞樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液、細(xì)胞等）檢測。HIV抗體、HBsAg、HCV抗體、TP抗體、CMV-IgM、HTLV抗體、HPV抗體、HHV抗體、EBV抗體檢測應(yīng)為陰性；HCV、HBV、HIV病毒核酸檢測應(yīng)為陰性；4)內(nèi)毒素檢測：參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法執(zhí)行，對肌肉干細(xì)胞樣本采集、運輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、凍存液等）檢測。各類樣本中的內(nèi)毒素檢測值應(yīng)≤0.5EU/mL。5)致瘤性檢測：采用免疫缺陷動物（裸鼠或SCID鼠），通過局部或靜脈方式接種肌肉干細(xì)胞，評價肌肉干細(xì)胞致瘤性。體內(nèi)致瘤試驗嚴(yán)格遵照動物倫理要求執(zhí)行，單只小鼠接種肌肉干細(xì)胞數(shù)量≥106細(xì)胞/kg，觀察期≥12周。肌肉干細(xì)胞應(yīng)無致瘤性。人體肌肉干細(xì)胞穩(wěn)定性人體肌肉干細(xì)胞穩(wěn)定性檢測項目包括：a）細(xì)胞數(shù)量和活率檢測：選用血球細(xì)胞計數(shù)板或細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，將待檢測細(xì)胞使用臺盼藍(lán)或A0/PI熒光染料染色，讀取細(xì)胞數(shù)并計算活率。各代數(shù)及批次肌肉干細(xì)胞活細(xì)胞比例≥90%。b）生長活性檢測：通過檢測細(xì)胞倍增時間、細(xì)胞周期、克隆形成率以及端粒酶活性對肌肉干細(xì)胞生長活性進(jìn)行測定，各代數(shù)及批次肌肉干細(xì)胞應(yīng)處于指數(shù)生長期，GO期細(xì)胞數(shù)≤10%，具有端粒酶活性。c）細(xì)胞純度和均一性檢測：采用肌肉干細(xì)胞表面標(biāo)志物流式檢測以及人基因組DNA短片段重復(fù)序列(STR)測序進(jìn)行檢定。各代數(shù)及批次肌肉干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)應(yīng)符合流式檢測比例要求，單一細(xì)胞系的肌肉干細(xì)胞各代次及批次細(xì)胞STR檢測結(jié)果應(yīng)保持一致。人體肌肉干細(xì)胞生物學(xué)特征人體肌肉干細(xì)胞生物學(xué)特征檢測項目包括：a）細(xì)胞形態(tài)檢測：顯微鏡下觀察，肌肉干細(xì)胞貼壁生長，呈短梭形外觀，形態(tài)均一，細(xì)胞之間無密切接觸；b）細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測：采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測定，肌肉干細(xì)胞表面標(biāo)志物Integrinα7、Notch1和細(xì)胞核內(nèi)標(biāo)志物Pax7、myogenin陽性率不低于95%；CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105陽性率不高于5%。c）分化能力檢測：采用體外條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，肌肉干細(xì)胞應(yīng)能夠分化為成肌肉、脂肪、骨、軟骨細(xì)胞。成肌分化經(jīng)觀察多核的肌管的形成鑒定，成脂分化經(jīng)油紅0染色法鑒定，成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定，成軟骨分化經(jīng)阿爾辛藍(lán)染色法鑒定。d）染色體核型檢測：采用G帶分析法進(jìn)行測定，肌肉干細(xì)胞染色體數(shù)量為46(含XX/XY)，無染色體缺失、異位和重排現(xiàn)象。質(zhì)控分類批次質(zhì)量檢驗人體肌肉干細(xì)胞制備機構(gòu)應(yīng)對由同一供體、同一時間、使用同一工藝采集和分離獲得的干細(xì)胞進(jìn)行例行批次質(zhì)量檢驗。當(dāng)制備工藝、耗材、試劑、場地或規(guī)模等條件發(fā)生時，制備機構(gòu)應(yīng)對多批次干細(xì)胞制劑進(jìn)行質(zhì)量檢驗，確保工藝和質(zhì)量穩(wěn)定合格，記錄入檔保存至少30年。質(zhì)量控制檢測表參見附錄A。放行質(zhì)量檢驗每一批次肌肉干細(xì)胞制劑在臨床使用前應(yīng)在完成例行質(zhì)量檢驗的基礎(chǔ)上，由干細(xì)胞臨床研究機構(gòu)質(zhì)檢平臺進(jìn)行快速和簡化的質(zhì)量檢測，應(yīng)包括但不限于活率、細(xì)胞表型、細(xì)菌、病毒、支原體和內(nèi)毒素含量等，確認(rèn)細(xì)胞合格后方可申請臨床放行使用。相關(guān)記錄報告應(yīng)入檔保存至少30年。復(fù)核質(zhì)量檢驗人體肌肉干細(xì)胞制備機構(gòu)應(yīng)對每一批次干細(xì)胞制劑單獨留樣保存，詳細(xì)記錄批號、代次、生產(chǎn)日期、來源等信息。定期由國家或地方相關(guān)部門授權(quán)的專業(yè)細(xì)胞檢驗機構(gòu)或?qū)嶒炇疫M(jìn)行肌肉干細(xì)胞制劑的質(zhì)量復(fù)核檢驗，并出具檢驗報告，入檔保存至少30年。復(fù)核質(zhì)量檢驗報告出具時間應(yīng)在該批次肌肉干細(xì)胞制劑提出放行申請之前，并作為放行檢驗參考。質(zhì)量評價與放行質(zhì)量評價內(nèi)容供者健康篩查結(jié)果應(yīng)符合合格供者要求并簽署了知情同意書。肌肉及檢測標(biāo)本的采集和運輸符合標(biāo)準(zhǔn)要求。肌肉及檢測標(biāo)本的接收、標(biāo)識以及暫存符合標(biāo)準(zhǔn)要求。細(xì)胞分離、處理、檢測區(qū)域應(yīng)滿足操作要求，有潔凈要求的操作環(huán)境應(yīng)滿足相應(yīng)級別環(huán)境要求，應(yīng)有定期環(huán)境監(jiān)控；細(xì)胞分離、處理各工序完畢后均應(yīng)及時清場；現(xiàn)場應(yīng)無污染及交叉污染，如有傳染病原體或污染物，應(yīng)得到有效隔離或清除。細(xì)胞在分離、處理及檢測等過程中所涉及的人員均已通過考核合格后上崗。細(xì)胞分離、處理、檢測等所使用的設(shè)備應(yīng)符合設(shè)備管理要求（標(biāo)識清晰正確，在合格計量校驗期內(nèi)定期維護(hù)保養(yǎng)等）；與細(xì)胞接觸的器械應(yīng)經(jīng)消毒滅菌并在有效期內(nèi)。細(xì)胞制備、檢測所用物料應(yīng)經(jīng)確認(rèn)來自合格供應(yīng)商，關(guān)鍵物料均應(yīng)經(jīng)抽樣檢測并確認(rèn)其質(zhì)量合格。試劑及耗材的有效期應(yīng)在規(guī)定期限內(nèi)，批號應(yīng)按照要求記錄下來以便具有可追溯性。應(yīng)核對供者檢測報告，其內(nèi)容至少包括：乙型肝炎病毒表面