第四章分子生物學研究方法課件

2024/10/301第七章分子生物學研究方法第一節(jié)重組DNA技術(shù)回顧第二節(jié)DNA基本操作技術(shù)第三節(jié)RNA基本操作技術(shù)第四節(jié)SNP的理論與應(yīng)用第五節(jié)基因克隆技術(shù)第六節(jié)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學技術(shù)2024/10/302第一節(jié)重組DNA技術(shù)回顧一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件第一，在20世紀40年代確定了遺傳信息的攜帶者：即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；

2024/10/303第二，50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機制，解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；

第三，50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達機制。2024/10/304但是：當時由于缺乏有效的分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學家無法對這類物質(zhì)進行直接的生化分析。隨著DNA分子體外切割與連接技術(shù)及核苷酸序列分析技術(shù)的進步直接推動了重組DNA技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展。2024/10/305重組DNA技術(shù)（recombination）：

是應(yīng)用酶學方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當?shù)乃拗骷毎羞M行擴增，形成大量的子代DNA分子的過程。2024/10/306工具酶：

限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）

DNA連接酶（DNAligase）工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是現(xiàn)代生物工程技術(shù)史上最重要的事件。2024/10/307（一）限制性內(nèi)切酶(RE)

1、概念：一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。

2、分類：

I型、II型、Ⅲ型2024/10/308

類型II：識別位點和酶切位點一致，具特異性。單體酶，性質(zhì)穩(wěn)定，Mg2+為輔助因子。目前已分離了數(shù)百種。

類型I：識別的DNA序列長約十幾個bp；酶切位點在距識別位點1kb左右處隨機切割，非特異性；復(fù)合酶，無使用價值。

類型Ⅲ：酶切位點在識別位點下游24-26bp處，非特異性。單體酶，如HgaI:GACGCnnnnn2024/10/3093、II型限制性內(nèi)切酶的基本特性5’…GCTGAATTCGAG…3’3’

…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點(1)識別dsDNA分子中4～8bp的特定序列(2)大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)(3)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)2024/10/3010EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端

5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’

EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’

POH2024/10/3011（二）DNA連接酶(ligase)

將兩段DNA片段連接起來的酶稱為DNA連接酶。1、E.coliDNAligase:連接粘端,催化需要NAD+參與2、T4DNAligase:連接粘端和平端，催化需要ATP參與都不連接單鏈2024/10/3012DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵

nickOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’POHDNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’2024/10/3013二、基因克隆的載體克隆用載體：是指具備自我復(fù)制能力的DNA分子。常見的分子克隆載體有：病毒、噬菌體、質(zhì)粒?？寺∮幂d體的選擇具備復(fù)制原點，能夠自我復(fù)制具備適合的酶切位點，且不在原點具有篩選指標對抗菌素的抗性基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)2024/10/3014載體的功能

運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件2024/10/3015三、基因克隆的操作

1、從復(fù)雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段；2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子；2024/10/30163、感受態(tài)細胞的制備—氯化鈣法第一次搖菌第二次搖菌離心收集細菌0.1MCaCl2重懸細胞,冰浴30min離心、重懸重復(fù)一次2024/10/30174、轉(zhuǎn)化（transformation）

感受態(tài)細胞與連接產(chǎn)物輕輕混勻,冰浴30min，42℃水浴熱激60–90s，快速冰浴2min加液體LB振蕩培養(yǎng)，使細胞復(fù)蘇。2024/10/30185、篩選（screening）①根據(jù)重組載體的表型

抗藥性（Ampr

、Tetr）

其他mark（

-互補篩選）②根據(jù)DNA限制酶的酶譜分析③

PCR反應(yīng)2024/10/3019基因克隆流程示意圖2024/10/3020

帶有負電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場中以一定的遷移率從負極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。一、核酸的凝膠電泳（一）基本原理：第二節(jié)DNA基本操作技術(shù)2024/10/3021電泳遷移率：電泳分子在電場作用下的遷移速度。與電場強度和電泳分子所帶的凈電荷成正比。與分子的摩擦系數(shù)成反比，摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)。支持介質(zhì)：穩(wěn)定，無反應(yīng)活性；2024/10/3022（二）種類

1)按凝膠材料分:聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳

2)按電泳裝置分:水平式/瓊脂糖凝膠;豎式/聚丙烯酰胺凝膠

3)兩種方法比較：分離效果和分離范圍;操作難易2024/10/3023瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取的一種線性多糖聚合物。將瓊脂糖粉未加熱到溶點后凝固，便會形成良好的介質(zhì)，其密度由瓊脂糖的濃度所決定。特點：分辨能力低，但應(yīng)用范圍廣，適用于較大分子的分析。適于分離200bp~50kb的DNA片段。操作簡便。2024/10/30242024/10/3025聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑過硫酸銨和加速劑TEMED(四甲基乙二胺）的作用下聚合而成。

聚合時，由單體丙烯酰胺聚合成鏈狀物，由交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺將鏈與鏈交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成立體的不溶于水的凝膠。2024/10/3026特點：分辨能力高，但應(yīng)用范圍小，適用于較小分子的分析。適于分離5bp~500bp的DNA片段。操作復(fù)雜。核酸分子的染料

溴化乙錠（EB），因具有扁平分子的空間結(jié)構(gòu)，能插入到DNA分子或RNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。2024/10/3027（三）

用途

瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。（四）

凝膠電泳的一般程序制膠點樣電泳染色觀察2024/10/30282024/10/30292024/10/3030二、細菌轉(zhuǎn)化細菌轉(zhuǎn)化（transformation）是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化的DNA菌株叫供體菌株，接受轉(zhuǎn)化的DNA菌株叫受體菌株。目前常用的轉(zhuǎn)化方法有CaCl2法(化學轉(zhuǎn)化法)和電轉(zhuǎn)化法。2024/10/3031感受態(tài)細胞的制備—氯化鈣法第一次搖菌第二次搖菌離心收集細菌0.1MCaCl2重懸細胞,冰浴30min離心、重懸重復(fù)一次2024/10/3032轉(zhuǎn)化（transformation）

感受態(tài)細胞與連接產(chǎn)物輕輕混勻,冰浴30分鐘，42℃水浴熱激60–90秒，快速冰浴2分鐘加液體LB振蕩培養(yǎng)，使細胞復(fù)蘇。2024/10/3033三、PCR基因擴增

聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction)，即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學獎。2024/10/3034

PCR特異性，即所擴增片段是由兩個人工合成的引物序列決定的。2024/10/3035PCR反應(yīng)原理①變性②退火③延伸2024/10/3036反應(yīng)體系的成分耐熱的DNA聚合酶PCR反應(yīng)的緩沖液Mg2+Tris?

Cl

引物dNTP模板DNA2024/10/3037溫度循環(huán)參數(shù)

變性：雙鏈DNA分子加熱分離成兩條單鏈DNA分子的過程。變性溫度：是指雙鏈DNA分子50％發(fā)生變性時的溫度，一般為94∽95℃2024/10/3038

退火：兩引物分別與兩條DNA的兩側(cè)序列特異性互補，形成雙鏈的過程稱為退火。退火溫度一般在50∽65℃之間，具體溫度與引物長度、堿基組成以及濃度有關(guān)。2024/10/3039

延伸：在適宜條件下，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，以4種脫氧核苷三磷酸（dNTP)為底物,在引物的誘導下，按5′→3′方向復(fù)制互補DNA的過程。延伸溫度一般為70∽75℃，此時DNA聚合酶活性最高。2024/10/3040時間參數(shù)

變性時間：決定于DNA的復(fù)雜性，一般選取94℃1min,因過長的高溫時間，會降低DNA聚合酶的活性；

退火時間：一般情況下取30s~1min，因為引物比較短；

延伸時間：根據(jù)擴增片段的長度而定，一般在1kb以內(nèi)的片段需延伸1min,更長的片段需相應(yīng)延長時間。

2024/10/3041引物1、引物長度在15∽30bp之間，引物的退火溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)2、堿基隨機分布避免一連串相同堿基，引物本身不應(yīng)存在互補序列，兩條引物間也不應(yīng)有互補性，尤其是3′端；2024/10/30423、G+C含量

G+C含量一般為40％∽60％4、引物3′端堿基的特異性。2024/10/3043PCR技術(shù)的特點：第一，特異性強第二，效率高第三，靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞第四，對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA2024/10/30442024/10/3045四、實時定量PCR

實時定量PCR技術(shù)：指利用帶熒光檢測的PCR儀對整個PCR過程中擴增DNA的累積速率繪制動態(tài)變化圖，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，從而測定終端產(chǎn)物的豐度。2024/10/3046

熒光探針事先混合在反應(yīng)管中，只有與DNA結(jié)合后才能被激發(fā)出熒光。2024/10/30475’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’Repeat非序列特異性的DNA結(jié)合的熒光探針BDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll與雙鏈DNA結(jié)合；與DNA結(jié)合后才發(fā)出熒光。2024/10/3048特異性的熒光探針

特異性的熒光探針是把熒光化合物標記到特異性的寡核苷酸上形成熒光標記的DNA探針。通過探針與PCR產(chǎn)物特異性的結(jié)合，在PCR過程中可對產(chǎn)物實現(xiàn)實時、定量檢測。2024/10/3049

TaqMan探針是一小段被設(shè)計成可以與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA（一般為5~50bp），并且該單鏈DNA的5’和3’端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團。2024/10/3050

當探針單獨存在時，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的作用而發(fā)生熒光猝滅。在PCR過程中，由于TaqDNA酶的5’-3’外切酶活性的作用，使探針的5’端的基團被切斷，加大了熒光基團間的的距離，被切下來的熒光基團恢復(fù)熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此，Taqman探針檢測的是積累熒光。5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ應(yīng)用TaqMan探針的實時定量PCR技術(shù)5’3’5’3’5’3’RQ5’3’Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’5’3’QTaqR3’5’5’3’3’QTaqR5’lR2024/10/3053實時定量PCR的絕對定量Ct值：指PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物熒光強度首次超過設(shè)定閾值時，PCR反應(yīng)所需的循環(huán)數(shù)。2024/10/3054

模板起始濃度越高，Ct值越小

Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系Ct值與模板起始濃度的關(guān)系

如果模板濃度增加1倍，Ct值就提前1個循環(huán)到達如果模板濃度減少1倍，Ct值就滯后1個循環(huán)到達絕對定量可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度。

（圖5-11）相對定量（兩個樣本中的基因表達水平進行比較）

（圖5-12）2024/10/3056五、基因組DNA文庫構(gòu)建

是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細胞獲得的所有陽性菌落，這個群體就稱為該生物基因組文庫。2024/10/3057基因組DNA文庫的類型根據(jù)所選用的載體可以分為：質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。2024/10/3058基因組DNA文庫的質(zhì)量標準一個理想的基因組DNA文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力;載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆;克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序;克隆片段易于從載體分子上完整卸下;重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選。2024/10/3059基因組DNA文庫構(gòu)建的程序①載體DNA的制備；②基因組DNA的提?。虎刍蚪MDNA的部分酶切、分離與回收；④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細胞；⑤重組克隆的挑選和保存。2024/10/30602024/10/3061第三節(jié)RNA基本操作技術(shù)一、總RNA的提取液氮研磨組織、勻漿加入Trizol試劑（異硫氰酸胍-苯酚）溶解細胞氯仿抽提異丙醇沉淀溶解在變性條件下采用電泳方法對其進行檢測2024/10/3062二、mRNA的純化

大部分真核生物的mRNA有3’poly（A）尾巴

oligo(dT)能與poly(A)尾巴互補，由此來獲得mRNA。AAAAAAAAAAn5’cap2024/10/30632024/10/3064分離mRNA的試劑盒可應(yīng)用PromegaPolyATtractmRNA分離系統(tǒng)分離poly(A)mRNA。將用生物素標識的寡聚(dT)引物與細胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA。2024/10/3065三、cDNA的合成

可同時在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機引物R6，以保證得到全長cDNA；

應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）；

應(yīng)選用甲基化dCTP(防止被限制性內(nèi)切酶切割)；

應(yīng)保證所獲得雙鏈cDNA的方向性(cDNA兩端加上不同內(nèi)切酶所識別的接頭序列);

因為絕大多數(shù)大腸桿菌細胞都會切除帶有5’-methylC的外源DNA，所以，應(yīng)選用mcrA-,mcrB-菌株。2024/10/30662024/10/3067定向cDNA的合成及分子修飾2024/10/3068四、cDNA文庫

將某種細胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，與載體連接，然后轉(zhuǎn)化宿主細胞，得到含全部表達基因的種群，稱為cDNA文庫。cDNA文庫具有組織細胞特異性。構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNAcDNA文庫只含有mRNA的分子結(jié)構(gòu),不含真核基因的間隔序列和調(diào)控區(qū)。2024/10/3069cDNA文庫的特點：①出發(fā)材料是一定時空條件下的細胞總mRNA,在轉(zhuǎn)錄水平上反映生物在特定發(fā)育時期、特定組織(或器官)在一定環(huán)境條件下的基因表達情況。②不同組織、細胞在不同時段的mRNA種類不同(即基因的表達譜不同)，同種生物的cDNA文庫有組織細胞的界定，如肝組織或胚胎組織。2024/10/3070分離純化目的基因

目的基因+vector=重組DNA分子2024/10/3071噬菌粒的包裝

含有cDNA插入片段的重組噬菌粒只有經(jīng)過體外蛋白外殼包裝反應(yīng)，才能成為具有侵染和復(fù)制能力的成熟噬菌體。2024/10/3072與載體連接成重組DNA侵染大腸桿菌進行克隆合成雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA從細胞中分離出mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶噬菌粒的包裝2024/10/3073五、基因文庫的篩選1、核酸雜交法平板上的菌落轉(zhuǎn)移硝酸纖維素膜溫育堿變性用蛋白酶K去除蛋白質(zhì)形成菌落DNA印跡80℃烘烤濾膜DNA固定與探針雜交檢測雜交結(jié)果2024/10/30742、PCR篩選法1）、設(shè)計特異性引物；2）、將文庫保存在多孔培養(yǎng)板上，對每個孔進行PCR擴增；3）、對陽性孔進行稀釋至次級孔，再對每個孔進行PCR擴增，直至鑒定出與目的基因?qū)?yīng)的單克隆。2024/10/30753、免疫篩選法適用范圍：表達文庫用某個基因產(chǎn)物的特異性抗體對重組克隆進行篩選。文庫鋪于平板轉(zhuǎn)移至NC保存原板,λ噬菌體表達加入一抗洗去一抗,加入二抗加底物顯色從保存板中挑出陽性菌落2024/10/30762024/10/3077第四節(jié)SNP理論及應(yīng)用

SNP，中文翻譯為單核苷酸多態(tài)性，指基因組DNA序列中由于單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。SNP轉(zhuǎn)換（2/3）：C→T，A→G顛換（1/3）：C→A，G→T，C→G，A→T位置基因編碼區(qū)（cSNP)基因周邊區(qū)（pSNP)基因間（iSNP)同義cSNP非同義cSNP2024/10/3078SNP的檢測技術(shù)1、基因芯片技術(shù)概念：就是將大量探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補配對原理，與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布進而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息。2024/10/3079基因芯片的工作原理：應(yīng)用已知核酸序列作為靶基因與互補的探針核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析。具體操作:①將許多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；②樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標記分子或放射性同位素作為探針；2024/10/3080③然后按堿基配對原理將兩者進行雜交;④再通過熒光或同位素檢測系統(tǒng)對芯片進行掃描，由計算機系統(tǒng)對每一探針上的信號作出比較和檢測，從而得出所需要的信息。2024/10/30812、Taqman技術(shù)

在反應(yīng)體系中加入2種不同熒光標記的探針，這兩個探針分別與兩個等位基因完全配對。探針設(shè)計運用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移；

Taq酶5'→3'外切酶的活性；通過不同熒光值的變化，對基因型進行分型。2024/10/30823、分子信標（MolecularBeaconProbe）是一種呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的熒光標記的寡核苷酸，環(huán)狀區(qū)與靶序列特異性結(jié)合，莖干區(qū)由5~8個堿基對組成，5'端帶有熒光發(fā)生基團，3'端帶有熒光猝滅基團。2024/10/3083RQQRExcitation分子信標（MolecularBeaconProbe）2024/10/30844、焦磷酸測序法是一種短片段焦磷酸測序技術(shù)，在測序引物的引導下，完成短片段（含SNP）的測序，從而實現(xiàn)基因分型。缺點：不能檢測長片段，對于重復(fù)序列沒有辦法。2024/10/3085原理:生成1分子dNTP加入1分子PPi與APS反應(yīng)ATP硫酸化酶的作用下生成ATP使螢光素氧化螢光素生成雙磷酸酶降解2024/10/3086原理1、測序引物與PCR擴增的單鏈DNA模板相結(jié)合。然后將其與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶，以及底物APS和熒光素一起孵育。2、4種dNTP之一被加入反應(yīng)體系，如與模板配對，此dNTP與引物的末端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團（PPi）釋放出來。而且釋放出來的PPi的量與和模板結(jié)合的dNTP的量成正比。2024/10/30873、ATP硫酸化酶在5’-磷酰硫酸腺苷(

adenosine5′phosphosulfate,APS）存在的情況下催化PPi形成ATP，ATP驅(qū)動螢光素酶介導的螢光素向氧化螢光素的轉(zhuǎn)化，氧化螢光素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號。光信號由CCD攝像機檢測并由相應(yīng)的軟件反應(yīng)為峰。每個光信號的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。2024/10/30884、ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應(yīng)體系。5、然后加入下一種dNTP。最終待測序列的順序，即可從反應(yīng)光強的信號峰中讀出。

在體系中使用的是dATPS而非dATP，因為dATPS不是熒光素酶的底物，而且DNA聚合酶對dATPS的催化效率更高。2024/10/3089SNP的應(yīng)用1、人類基因單倍型圖的繪制；2、SNP與人類疾病易感基因的相關(guān)性分析；3、指導用藥與藥物設(shè)計。2024/10/3090第五節(jié)基因克隆技術(shù)克隆