BDAccuriC6Plus基礎操作流程

BDAccuriC6Plus基礎操作流程BDAccuriC6Plus光路信息:（濾光片可根據(jù)需求更換，下表為常用配置）激發(fā)器檢測器濾光片檢測熒光488nmFL1533/30FITC、GFP、Alexa488FL2585/40PE、PIFL3670LPPI、PerCP、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy7640nmFL4675/25APC、PE-Cy5、Alexa647開機2.1檢查所有瓶中的液體，鞘液桶補滿鞘液（2L），廢液桶倒空，清洗液和消毒液各250mL清洗液：1%BDFACSCleaningsolution消毒液：BDdetergentsolutionconcentrate(3mlBDdetergentsolution+197mlddH2O)上樣管裝2mLddH2O，套于上樣針下，輕輕拉出樣品支架托住上樣管。本儀器采用的是蠕動泵負壓液流系統(tǒng)，上樣管可以不用封閉，因此可以使用多種EP管和流式管作為上樣管；按下儀器前方電源鍵，雙擊打開電腦上CFlow軟件，軟件的工作面板（workspace）分布如下圖，或者在File下點擊NewWorkspace打開新的workspace：儀器啟動期間，軟件界面上儀器當前狀態(tài)會顯示黃色的燈，該過程中儀器會用鞘液沖洗液流管路，持續(xù)大約13分鐘，直到顯示綠燈；當儀器狀態(tài)顯示綠燈時，表示儀器和軟件連接完成。質控3.1點擊面板上的”InstrumentQC”,進入質控界面；500ulddH2O+1滴BDCS&TRUOBead（#661414、661415），混勻BDCS&TBeadLot選擇CS&T小球的批號（注意不是貨號），如沒有則在Install下倒入對應的批號文件；點擊RUN開始獲取數(shù)據(jù)；結束后取下質控小球，放上一管ddH2O；分析質控數(shù)據(jù)，Noise數(shù)據(jù)不要分析，直接看BDCS&TBeads;在FSC和SSC中圈中Dim和Mid+Bright兩圈小球；；后面幾個熒光通道的圖中圈中最亮的那群小球，不要圈到其它信號；質控報告顯示本次質控是否通過；3.9點擊History:Levey-Jennings查看質控歷史。4．上樣4.1新建一個Workspace，點一個空白樣本孔，用ddH2O運行2分鐘；4.2上樣品，設置收集的限制條件，樣品流速（建議設置條件的時候選擇慢速上樣）和閾值，系統(tǒng)默認的閾值是FSC-H80000，注意未達到閾值的信號都不會被記錄和保存，可以點擊setthreshold自己設置閾值；4.3畫圖（散點圖、密度圖和直方圖），設門，命名坐標軸；4.4點擊流式圖中的GATE可以打開套嵌門設置面板，根據(jù)實驗要求，選擇include、exclude或者多個門的交集intersection，選擇門是來自于是在上一級門中還是來自于第一級所有的events（onallevents）；4.4每個樣品之間，用ddH2O運行10s以免數(shù)據(jù)交叉污染（根據(jù)實際情況自行調整）。5.調節(jié)補償5.1如果用多熒光標記，為了避免熒光信號漏到其它檢測通道，需進行補償調節(jié)，C6的補償調節(jié)可以在數(shù)據(jù)收集完畢后脫機進行；5.2收集完陰性和單陽樣本后（也可以等所有樣本都收集完畢），利用陰性樣本畫出十字門，然后點擊一個單陽的樣本孔，點擊面板上的SetColorCompensation，打開補償調節(jié)面板；5.3例如用FL2通道的熒光素調節(jié)FL1的補償，則如圖所示在FL1中減去X%FL2，最后使FL1完全為陰性，且FL2陽性群的中心與陰性群的中心平行（橫平豎直），其它通道同理，點擊apply預覽，可以繼續(xù)調節(jié)，點擊Applytoallsamples將補償值應用到所有樣本。5.4如果做四色的補償，例如FITC/PE/PerCP/APC四個熒光染料，如下作圖：四個通道都需兩兩調節(jié)補償。用FITC單陽管調節(jié)PE/PerCP/APC的補償，即分別用PE/PerCP/APC-X%FITC；用PE單陽管調節(jié)FITC/PerCP/APC的補償，即分別用FITC/PerCP/APC-X%PE；PerCP和APC以此類推。簡單記憶：上哪根單陽管，就用其他通道減去該單陽管的熒光，上誰減誰。6．數(shù)據(jù)分析6.1數(shù)據(jù)收集完畢后，可打開Analyze、Statistics或BatchAnalysis分析；6.2Analyze中，可以用相同的Plots和Gates分析多個樣本的數(shù)據(jù)，也可以以任意組合方式查看幾個plots和樣本數(shù)據(jù)，還能生成不同顏色疊加的直方圖；6.3Statistics中將來自多個樣本的數(shù)據(jù)列在一個表格中進行分析；6.4BatchAnalysis最為常用，整合了Analyze和Statistics的基本功能，可以批量分析一批數(shù)據(jù)并顯示流式圖和統(tǒng)計結果，并批量導出為PPT或者EXCEL格式。6.5導出數(shù)據(jù)：選擇File>ExportFCSFile，以FCS格式導出并保存當前的數(shù)據(jù)。選擇File>Saveworkspace保存帶數(shù)據(jù)的模板。選擇File>Savetemplate保存不帶數(shù)據(jù)的模板，workspaceortemplate文件雙擊可以直接打開。選擇File>ExportPlotDataasCSV以.csv格式（類似于txt）保存一個統(tǒng)計數(shù)據(jù)。選中統(tǒng)計表格，Edit>Copy，可以直接粘貼到excel或者word中，選中圖按住鼠標左鍵可以直接拖出保存圖片。7.關機7.1上樣完畢后，用SIP程序清洗進樣針，根據(jù)提示先上2ml1%FACSClean，再上2mlddH2O；7.2保證清洗液和消毒液的量，在進樣針上放2mlddH2O，按下儀器上電源鍵，儀器自動運行13mincleaningthefluidics程序，然后自動關機，儀器和軟件沒有先后開關順序。8.儀器維護8.1在上樣針下放一個空管，點擊backflush，進行排氣泡或者排堵；8.2一個月或者覺得儀器運行雜質比較多時，可運行Extendflowcellclean，儀器會在流動室充滿清洗液的情況下自動關機，使流動室充分浸泡在清洗液中：在上樣針處放至少500ulExtendflowcellcleansolution；在Instrument菜單下點擊Extendedcleanofflowcell；儀器一次會吸入500ul延長清洗液，然后自動關機，