DB35T 1852-2019 豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光RT-PCR檢測方法

DB35Detectionmethodsofreal-timeRT-PCRforPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevi福建省市場監(jiān)督管理局發(fā)布*I 1 1 1 1 2 4 5 6瑞德利校準檢測技術有限公司、東莞市中鼎檢測技術有限本標準主要起草人：鄭騰、張體銀、朱海、楊榮淇、付輝、張險朋、柯麗群、張志燈、林杰、1豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光RT-PCR檢測方法本標準規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光RT-P本標準適用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的流行病病學調查、監(jiān)測凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格Ct值：循環(huán)閾值（CycleThreDEPC：焦碳酸二乙酯（DiethyPyrocarbonaPRRS：豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndroPRRSV：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratRNA：核糖核酸（RibonucleicRT-PCR：反轉錄聚合酶鏈式反應（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReacti4疾病概述4.1病原是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈球型，直徑為554.2流行病學是PRRSV流行病學的重要特征。PRRSV可在感染豬體內存在很長時間。豬在感染病毒后2～14周均可通過2后感染PRRSV的新生仔豬，呼吸困難、急促，同時出現眼周及眼瞼水腫，結膜炎，藍耳，食欲不振，發(fā)熱，皮膚紅斑，腹瀉，震顫，毛發(fā)粗亂，厭食和神經癥狀。斷乳仔豬感染PRRSV的典型臨床癥狀表現為發(fā)熱、肺炎、昏睡及精神萎靡，如果伴發(fā)細菌感染，則死亡率顯5.1設備、材料和試劑5.1.1設備5.1.1.3冰箱（2℃~8℃和-20℃)。5.1.2材料和試劑5.1.2.3Trizol。5.1.2.5異丙醇。5.1.2.72×TaqPCRMasterMix。a)PRRSV-F5’-CACTACGGTCAACGGCACATT-3’；b)PRRSV-R5’-GCATATTTGACAAGGTTTACCACTCC-3’；c)PRRSV-PFAM-CTTTTCTGCCACCCAACACG擴增片段約99bp，用水溶解至10μmol/L后，保存于-5.1.2.9質控物質：陽性對照為含PRRSV基因目的片段5.2樣品的采集、處理、存放和運輸5.2.1樣品采集和前處理過程的注意事項35.2.2.1棉拭子樣品鼻腔拭子和肛門拭子一起放入盛有1.0mL拭子懸液（符合附錄A中A.1的規(guī)定）的無菌Eppendorf管中，5.2.2.2組織樣品采集有明顯病變的淋巴結、扁桃體、肺、脾、腎、胸腺等組織樣品，無菌取0.5g0.3mL～0.5mL的組織懸液（符合附錄A中A.2的規(guī)定）進行勻漿混勻，轉入無菌Eppendorf管中，5.2.2.3血清樣品在實驗室操作過程中首先應嚴格遵守GB19489的要求。分別取200μL待檢樣品，加入1mLTri試劑，用移液器充分吹打10～20次，室溫放置5min；加入200μL三氯甲烷，旋渦振蕩30放置15min；4℃下12000r/min離心15min；取上層水相加入等體積異丙醇，上下顛倒數次混勻，離心10min，棄上清液，沉淀室溫干燥5min；加20μLDEPC水溶解RNA沉淀。-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，RNA溶液應避免反復凍融，并盡快用于檢測。空白對照RNA提取也可采用等效的商品化RNA提在0.2mLPCR反應管中分別加入如下試劑：2×TaqPCRMasterMix12.5μL；10μmol/L的正向將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，擴增反應條件設定：50℃逆轉錄15min；94℃預變性3min；過正常陰性對照擴增曲線的最高點為準，具體根據儀器噪音情陽性對照樣品有對數擴增曲線，而且Ct值≤30；陰性對照和空白對照無擴增曲線，而且Ct值＞40檢驗樣本Ct值≤35時，報告為豬繁殖與呼吸綜合征病豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性，否則報告為豬繁殖與呼吸綜合征病樣本Ct值為零或Ct值＞40時，報告未檢出豬繁殖與呼吸綜合征病45.4.4測序5試劑的配制A.1拭子懸液和制霉菌素（5000IU/mL調節(jié)pH至7.2～7.4。A.2組織懸液制霉菌素（1000IU/mL調節(jié)pH至7.2～7.6