實(shí)驗(yàn)四-考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（四）考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

目前常用的5種經(jīng)典方法：

凱式定氮法（Kjedahl法）紫外吸收法雙縮脲法（Biuret法）

Folin-酚試劑法（Lorry法）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）

（一）凱式定氮法原理：蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。蛋白質(zhì)與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量=含氮量*6.25蛋白質(zhì)中的胺根在強(qiáng)熱和CuSO4，濃H2SO4

作用下，硝化生成（NH4）2SO4，反應(yīng)式為：

2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4

（其中CuSO4做催化劑）在凱氏定氮器中與堿作用，通過(guò)蒸餾釋放出NH3，收集于H3BO3

溶液中，反應(yīng)式為:(NH4)3SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O用已知濃度的H2SO4（或HCI）標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)HCI消耗的量計(jì)算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量，反應(yīng)式為：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3干擾物質(zhì)：

非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）缺點(diǎn)：

操作比較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)（8-10小時(shí)）靈敏度低，適用于0.2-1.0mg氮測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)：

測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、干擾少常用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

（二）雙縮脲法（Biuret法）原理：雙縮脲是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或通過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物在540nm處有最大吸收，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。干擾物質(zhì)：

硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等缺點(diǎn)：

靈敏度低1-20mg優(yōu)點(diǎn)：

快速（20-30min）、干擾物質(zhì)少不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近此法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。

（三）紫外吸收法原理：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm附近具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定280nm處的吸光度值可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260

1.8純核酸的光吸收比值：A280/A260

0.5蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280－0.74×A260(mg/ml)干擾物質(zhì)：

嘌呤、嘧啶、核酸等（可適當(dāng)校正核酸的干擾）缺點(diǎn)：

準(zhǔn)確度較低、干擾物質(zhì)多優(yōu)點(diǎn)：

簡(jiǎn)便、靈敏（50-100μg）、快速（5-10min）不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用此法適用于只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。

（四）Folin-酚試劑法（Lowry法）原理：此法是雙縮脲法的發(fā)展，在堿性溶液中銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin試劑），產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比。干擾物質(zhì)：

酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等；干擾雙縮脲的物質(zhì)同樣干擾Lorry反應(yīng)，且對(duì)后者影響更大。

缺點(diǎn)：

費(fèi)時(shí)（40-60min）、干擾物多

優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度高~5μg

這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一，應(yīng)用比較廣泛。

（五）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）原理：考馬斯亮藍(lán)G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也有棕黑色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm下測(cè)定的吸光度值與蛋白質(zhì)的濃度成正比。干擾物質(zhì)：

TritonX-100、SDS、強(qiáng)堿性緩沖液等缺點(diǎn)：

仍有一定的偏差（各種蛋白質(zhì)中精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同）優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度高，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1μg

快速（5~15min）、簡(jiǎn)便、干擾物少此法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法，得到廣泛的應(yīng)用。五種不同蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明凱氏定氮法(Kjedahl法)靈敏度低,適用于0.2~1.0mg氮,誤差為

2％費(fèi)時(shí)8～10小時(shí)將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮(可用TCA沉淀蛋白質(zhì)而分離)用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定;干擾少;費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)雙縮脲法(Biuret法)靈敏度低1～20mg中速20~30分鐘多肽鍵＋堿性Cu2＋

紫色絡(luò)合物硫酸銨;Tris緩沖液；某些氨基酸用于快速測(cè)定,但不太靈敏;不同蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收法較為靈敏50～100

g快速5～10分鐘各種蛋白質(zhì)中的Tyr和Trp殘基在280nm處的光吸收嘌吟和嘧啶；各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測(cè)；核酸的吸收可校正Folin－酚試劑法(Lowry法)靈敏度高～5

g慢速40～60分鐘雙縮脲反應(yīng);磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨;Tris緩沖液;甘氨酸;各種硫醇耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)靈敏度最高1～5

g快速5～15分鐘考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),其

max由465nm變?yōu)?95nm強(qiáng)堿性緩沖液；TritonX-100;SDS最好的方法;干擾物質(zhì)少;顏色穩(wěn)定;顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

值得注意的是，除凱氏定氮法外，其余四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。此外，有BCA法和膠體金檢測(cè)法。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆湛捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法。進(jìn)一步熟悉分光光度計(jì)的原理和操作。

考馬斯亮藍(lán)法

Bradford

1976年由Bradford建立的考馬斯亮藍(lán)法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定方法之一。

Bradford法比Lowry法靈敏度約高4倍，比紫外吸收法高10-20倍。實(shí)驗(yàn)原理1、考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料最大吸收峰位置,由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。染料主要是與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸和芳香氨基酸殘基結(jié)合。2、在595nm下測(cè)定的吸光度A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

Bradford法的優(yōu)點(diǎn)(1)靈敏度高

其最低檢測(cè)蛋白質(zhì)含量可達(dá)1ug/mL，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料相結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的吸光系數(shù)，因而光吸收要比Folin–酚試劑法大得多。(2)測(cè)定快速簡(jiǎn)潔

只需要加一種試劑，由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，因此完成一個(gè)樣品的測(cè)定只要5分鐘左右。其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。(3)干擾物質(zhì)少一些陽(yáng)離子如K+、Mg+、Na+和硫酸銨等不干擾測(cè)定。

干擾物質(zhì)：去污劑、SDS、TritonX-100

(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford

法用于不同蛋白質(zhì)時(shí)有較大的偏差，最好選用與待測(cè)樣品氨基酸成份相同的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有去污劑等。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線形，因而不能用比爾定律進(jìn)行計(jì)算而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。Bradford法的缺點(diǎn)試劑與器材1.試劑:

(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用牛血清白蛋白配制成0.1mg/mL

(2)考馬斯亮藍(lán)G-250：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL95%的乙醇后，再加入120mL85%的磷酸，用水稀釋至1L。2.器材(1)可見(jiàn)光分光光度計(jì)(2)試管：9支

管號(hào)123456789

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)

00.10.20.40.60.81.0(0.1mg/mL)

未知蛋白質(zhì)

0.20.6

蒸餾水

1.00.90.80.60.40.200.80.4

考馬斯亮藍(lán)

G－250

5.05.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

充分振蕩混勻后，兩分鐘于595nm處比色。實(shí)驗(yàn)步驟以蛋白質(zhì)質(zhì)量為X軸，吸光度A為Y軸做圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品蛋白質(zhì)含量。（2）取9支試管，編號(hào)為0～7號(hào)和樣品管。0號(hào)管加入1.0ml水，1～6號(hào)和樣品管依次加入對(duì)應(yīng)的蛋白稀釋液與水。然后各加入5.0ml蛋白質(zhì)染色液。充分振蕩混勻后，兩分鐘于595nm處比色。以蛋白質(zhì)濃度為X軸，吸光度A為Y軸做圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品蛋白質(zhì)含量。注意

比色皿一定先用水洗，然后用乙醇洗，再用水洗凈。測(cè)量時(shí)從低濃度開(kāi)始測(cè)量，這樣可以不用清洗比色皿。考馬斯亮藍(lán)G-250和R-250的區(qū)別G250

比考馬斯亮藍(lán)R250多二個(gè)甲基，染色靈敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。優(yōu)點(diǎn)在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體,能選