菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測(cè)定

菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測(cè)定主要內(nèi)容菌落總數(shù)測(cè)定大腸菌群測(cè)定MPN法原理（拓展內(nèi)容）掌握菌落總數(shù)測(cè)定方法01實(shí)驗(yàn)原理不同稀釋度的樣品，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36℃，48h（水產(chǎn)品30℃，72h），菌落數(shù)02菌落總數(shù)測(cè)定菌落總數(shù)測(cè)定器材與試劑：樣品，無(wú)菌生理鹽水，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，1ml吸管，培養(yǎng)皿”菌落總數(shù)測(cè)定傾注培養(yǎng)培養(yǎng)結(jié)果菌落計(jì)數(shù)：肉眼觀察，可用放大鏡，可標(biāo)記必要時(shí)分區(qū)計(jì)數(shù)，菌落成片者作廢實(shí)驗(yàn)步驟某稀釋度的菌落數(shù)：兩平板菌落數(shù)取平均值選擇菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度僅有一個(gè)稀釋度在此范圍：菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)計(jì)算方法菌落總數(shù)測(cè)定菌落總數(shù)測(cè)定計(jì)算方法：（2）有兩個(gè)稀釋度在30-300之間菌落數(shù)之比>2，選較小值菌落數(shù)之比<2，取平均值（3）所有稀釋度均>300

取稀釋倍數(shù)最大者（4）所有稀釋度均<30

取稀釋倍數(shù)最小者（5）沒(méi)有任何稀釋度在30-300之間選最接近該范圍者結(jié)果單位：CFU/ml（g）無(wú)菌操作標(biāo)記何時(shí)更換吸管吸吹混勻瓊脂培養(yǎng)基保溫安全常識(shí)注意事項(xiàng)：菌落總數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理℃，48h，產(chǎn)氣（小倒管）三步法：初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵器材與試劑樣品、無(wú)菌生理鹽水、LST肉湯，BGLB肉湯1ml吸管、10ml吸管、試管、小倒管大腸菌群數(shù)測(cè)定初發(fā)酵器材與試劑樣品、225ml無(wú)菌生理鹽水、9ml無(wú)菌生理鹽水、雙料LST肉湯，單料LST肉湯，10ml吸管、1ml吸管、吸球?qū)嶒?yàn)步驟：01初發(fā)酵02大腸菌群數(shù)測(cè)定吸取樣品方法加注樣品初發(fā)酵結(jié)果右邊為陽(yáng)性結(jié)果，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)發(fā)酵選取產(chǎn)氣試管接種至10mlBGLB肉湯中培養(yǎng)：36℃，48h觀察指標(biāo)：若產(chǎn)氣則報(bào)告大腸菌群陽(yáng)性。大腸菌群數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟

2.分離培養(yǎng)（1）制備伊紅美藍(lán)平板：

45℃，無(wú)菌，傾注，15ml

（2）選產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（3）接種至伊紅美藍(lán)平板分區(qū)劃線法（4）培養(yǎng)：36℃，48h分離培養(yǎng)器材與試劑初發(fā)酵結(jié)果（4只發(fā)酵管）、酒精燈、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)劃下一個(gè)區(qū)前必須滅菌接種環(huán)劃線時(shí)接種環(huán)同平板呈30-40°角每次劃線應(yīng)該壓到上一個(gè)區(qū)域的2-3條線用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動(dòng)操作要點(diǎn)分區(qū)劃線法大腸菌群數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟分離培養(yǎng)：菌落特征：深紫黑色、有金屬光澤紫黑色、無(wú)或略有金屬光澤淡紫紅色、中心顏色深革蘭染色、鏡檢：選特征菌落革蘭染色法器材與試劑結(jié)晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、酸性復(fù)紅、生理鹽水、酒精燈、載玻片、濾紙1涂片：接種環(huán)，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻2熱固定：通過(guò)火焰若干次3初染：結(jié)晶紫一滴，1min，水洗6復(fù)染：復(fù)紅一滴，30s5脫色：95%乙醇，30s或至無(wú)色為止4媒染：盧戈碘液一滴，1min，水洗革蘭染色法涂片熱固定初染媒染脫色復(fù)染革蘭染色法革蘭氏染色陰性革蘭氏染色陽(yáng)性復(fù)發(fā)酵器材與試劑培養(yǎng)24小時(shí)后的伊紅美蘭平板、酒精燈、接種環(huán)、復(fù)發(fā)酵管實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)發(fā)酵選取鑒定為無(wú)芽孢G-桿菌的菌落1-3個(gè)接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液培養(yǎng)：37℃，24h觀察指標(biāo)：產(chǎn)酸，產(chǎn)氣大腸菌群數(shù)測(cè)定液體接種復(fù)發(fā)酵復(fù)發(fā)酵陽(yáng)性結(jié)果，培養(yǎng)基變成黃色，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生無(wú)菌操作吸管使用洗去染液的方法顯微鏡保養(yǎng)液體接種注意事項(xiàng)：大腸菌群數(shù)測(cè)定MPN法（MostProbableNumberMethod）01目的：對(duì)某種細(xì)菌進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)02核心思想：泊松分布03實(shí)施方法：多次稀釋直至無(wú)菌，每個(gè)稀釋度分別接種若干培養(yǎng)管，根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)估算MPN值04MPN法原理MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）1細(xì)菌進(jìn)入發(fā)酵管的概率近似服從泊松分布:P(x=k)=e-x×xk/k!x:細(xì)菌濃度，k:進(jìn)入發(fā)酵管的細(xì)菌數(shù)2若在n管發(fā)酵中，令接種水樣量為Vi，陽(yáng)性管數(shù)為Pi，陰性管數(shù)為Qi，則該檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)生的概率為：其中C為常系數(shù)V為總水樣量，x為細(xì)菌個(gè)數(shù)3MPN法原理當(dāng)y(x)max，XMPN由于y(x