生物學(xué)案：專(zhuān)題課題土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專(zhuān)精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專(zhuān)精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專(zhuān)精課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)問(wèn)題導(dǎo)學(xué)一、研究思路活動(dòng)與探究11．尋找目的菌株的思路是什么?2．閱讀教材第22頁(yè)第一段旁欄中的相關(guān)內(nèi)容，并思考回答下列問(wèn)題.（1)在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？瓊脂的作用是什么？（2）該培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的?(3）該培養(yǎng)基屬于何種類(lèi)型?3．樣品中微生物數(shù)量的統(tǒng)計(jì)思路是什么？4．用活菌計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)時(shí)，為什么統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)比活菌的實(shí)際數(shù)目低?5．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目時(shí)，選擇具有多少菌落數(shù)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？教材中第22頁(yè)楷體字部分所列舉的兩位同學(xué)對(duì)菌落數(shù)的統(tǒng)計(jì)，哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實(shí)值?他們的實(shí)驗(yàn)需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？遷移與應(yīng)用1用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確的是（）。A．涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230B．涂布了兩個(gè)平板,統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C．涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D．涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）原理利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物數(shù)量當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落,來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌操作方法（1）用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí),先將待測(cè)樣品制成懸液。(2）取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。（3）根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)（1）設(shè)置重復(fù)組,增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。（2）為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一定要選擇恰當(dāng)?shù)南♂尪?。?)選擇菌落數(shù)在30～300的平板計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均值缺點(diǎn)不能區(qū)分死菌與活菌，難以計(jì)數(shù)微小的細(xì)菌。不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度只能計(jì)活菌數(shù)，受稀釋度影響很大二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)活動(dòng)與探究21．閱讀教材中第22～23頁(yè)“（三)設(shè)置對(duì)照”內(nèi)容中的楷體字部分，請(qǐng)幫助A同學(xué)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以排除其他同學(xué)所質(zhì)疑的可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素。2．為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？3．決定樣品稀釋度的因素是什么？一般而言,測(cè)定細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量所選擇的稀釋度分別是多少?4．在對(duì)菌落計(jì)數(shù)時(shí),為什么要每間隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目？5．測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是什么？遷移與應(yīng)用2下列關(guān)于微生物分離和培養(yǎng)的有關(guān)敘述，錯(cuò)誤的是(）。A．微生物培養(yǎng)前，需對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行消毒B．測(cè)定土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)目，常用菌落計(jì)數(shù)法C．分離土壤中不同的微生物,要采用不同的稀釋度D．分離能分解尿素的細(xì)菌，要以尿素作為培養(yǎng)基中唯一的氮源1．“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)”的實(shí)驗(yàn)步驟土壤取樣(從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中，用無(wú)菌小鐵鏟鏟去表層土，迅速取土壤并裝入無(wú)菌信封密封）制備培養(yǎng)基（準(zhǔn)備選擇培養(yǎng)基）樣品的稀釋(在火焰旁稱(chēng)取土壤10g，放入盛有90mL無(wú)菌水的三角燒瓶中，振蕩使土樣與水充分混合,將菌分散。制成10倍土壤稀釋液，用一支1mL無(wú)菌吸管從中吸取1mL土壤懸液注入盛有9mL無(wú)菌水的試管中,吹吸三次,使其充分混勻，制成102倍土壤稀釋液，以此類(lèi)推制成103、104、105、106倍土壤稀釋液）取樣涂布（在上述培養(yǎng)基的9個(gè)平板底面，每三個(gè)一組分別用記號(hào)筆寫(xiě)上104、105、106倍的三種稀釋液，然后用三支1mL無(wú)菌吸管分別由104、105、106倍的三管土壤稀釋液中吸取0.1mL對(duì)號(hào)放入已寫(xiě)好稀釋度的平板中,用無(wú)菌涂布器在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻）培養(yǎng)觀察(將培養(yǎng)基平板倒置于30～37℃溫室中培養(yǎng)1～2天，每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，算出同一稀釋度的三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)）2．實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（1）建立“無(wú)菌觀念",整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程要嚴(yán)格無(wú)菌操作:實(shí)驗(yàn)器材、工作臺(tái)、實(shí)驗(yàn)者、空氣都要嚴(yán)格消毒滅菌,包括取土樣的小鐵鏟和盛土樣的信封使用前也要滅菌。（2）稱(chēng)取、稀釋都要在酒精燈火焰附近的無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行.（3）規(guī)范操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后一定要洗手、消毒，以防被致病微生物感染。3．結(jié)果分析與評(píng)價(jià)內(nèi)容現(xiàn)象結(jié)論有無(wú)雜菌污染的判斷未接種的培養(yǎng)皿中無(wú)菌落生長(zhǎng)未被雜菌污染選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目選擇培養(yǎng)基具有篩選作用樣品的稀釋操作得到2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30~300的平板操作成功重復(fù)組的結(jié)果若選擇同一種土樣，統(tǒng)計(jì)結(jié)果應(yīng)接近答案:課前·預(yù)習(xí)導(dǎo)學(xué)【預(yù)習(xí)導(dǎo)引】一、1．不能土壤中的細(xì)菌脲酶2．人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件Taq細(xì)菌預(yù)習(xí)交流1:提示:（1）在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。例如，加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可以得到金黃色葡萄球菌。這里的加入是在培養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上加入.（2）改變培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分。例如,缺乏氮源時(shí)可以分離固氮微生物;石油作為唯一碳源時(shí)，可以分離出能消除石油污染的微生物；缺乏碳源時(shí)可以分離自養(yǎng)微生物。（3）改變微生物的培養(yǎng)條件。例如,將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)可以得到耐高溫的微生物.3．（1）活菌計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（2）①多于330～300平均數(shù)②少菌落數(shù)活菌數(shù)4．比照實(shí)驗(yàn)組，排除其他因素的干擾，證明確實(shí)是所測(cè)試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果二、1．實(shí)驗(yàn)方案，所需儀器、材料、用具具體的實(shí)驗(yàn)步驟2．3~8cm70％～90%3．菌落數(shù)在30~300之間，適于計(jì)數(shù)104、105、106103、104、105102、103、1044．30~37℃25～28℃25～28℃3~4d統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目菌落數(shù)目穩(wěn)定遺漏菌落的數(shù)目5．形狀大小顏色預(yù)習(xí)交流2:（1)提示：1個(gè)菌體對(duì)應(yīng)生命系統(tǒng)的細(xì)胞層次和個(gè)體層次；1個(gè)菌落對(duì)應(yīng)生命系統(tǒng)的種群層次。（2)提示：如不考慮基因突變,構(gòu)成同一個(gè)菌落的細(xì)菌應(yīng)具有相同的遺傳物質(zhì)，因?yàn)榧?xì)菌的增殖方式不是減數(shù)分裂,不發(fā)生遺傳基因的重組.（3)提示:統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板,計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按公式：每克樣品中的菌株數(shù)＝（C/V）×M進(jìn)行計(jì)算，其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積（mL），M代表稀釋倍數(shù).三、1．（1）滅菌（2）火焰旁棉塞（3)火焰旁(4）培養(yǎng)基類(lèi)型、培養(yǎng)日期、平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度2．（1）脲酶堿性pH的變化（2）尿素酚紅紅課堂·合作探究【問(wèn)題導(dǎo)學(xué)】活動(dòng)與探究1：1．提示:根據(jù)目的菌株對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。2．（1）提示:碳源主要是葡萄糖，氮源是尿素.瓊脂的作用是作為凝固劑。（2)提示：該培養(yǎng)基對(duì)微生物有選擇作用.該培養(yǎng)基的氮源比較特殊，是尿素，只允許能以尿素作為氮源的微生物生長(zhǎng)。（3）提示：該培養(yǎng)基屬于固體培養(yǎng)基，又屬于選擇培養(yǎng)基.3．提示:當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)可推知樣品中的活菌數(shù)。4．提示:因?yàn)閷?duì)細(xì)菌接種時(shí)存在兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相連的現(xiàn)象，當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。5．提示：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目時(shí),一般選擇數(shù)目為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，目的是保證結(jié)果準(zhǔn)確。兩位同學(xué)的結(jié)果都不太接近真實(shí)值，他們的實(shí)驗(yàn)都需改進(jìn)。兩位同學(xué)都需要重新實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)時(shí)要至少設(shè)置3個(gè)組別，選擇菌落數(shù)為30～300的平板計(jì)數(shù)并且求平均值。遷移與應(yīng)用1：D解析：在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性，所以A、B兩項(xiàng)不正確.C項(xiàng)雖涂布了3個(gè)平板，但是,其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另兩個(gè)相差太遠(yuǎn),說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤,因此,不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來(lái)求平均值.因此，正確答案為D。活動(dòng)與探究2:1．提示：另增加兩個(gè)組別：一個(gè)不進(jìn)行接種，但培養(yǎng)條件和其他組別完全相同,以排除培養(yǎng)基被雜菌污染的可能；一個(gè)接種不能以尿素為氮源的微生物，培養(yǎng)條件和其他組別完全相同，以排除培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)的可能。2．提示:土壤中各類(lèi)微生物的數(shù)量（單位：個(gè)/kg)是不同的，如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬(wàn)，放線菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23．1萬(wàn)。因此，為獲得不同類(lèi)型的微生物,就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件.3．提示:決定樣品稀釋度的主要因素是樣品中要測(cè)定的微生物的數(shù)量，數(shù)量越多稀釋度應(yīng)越大。由于細(xì)菌菌體小、繁殖快、數(shù)量多，所以稀釋度一般較大，為104～106；放線菌為103～105；真菌菌體大、繁殖慢、數(shù)量少，稀釋度一般較小，為102～104.4．提示：菌種中有些菌體增殖快,有些菌體增殖慢，所以培養(yǎng)時(shí)間要充足,使得每個(gè)菌體都能形成肉眼可觀察到的菌落。并且選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的數(shù)據(jù)作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而遺漏某些菌落。5．提示:將一定體積的水用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后,將濾膜放在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng),大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過(guò)計(jì)數(shù)得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量.遷移與應(yīng)用2：A解析:微生物培養(yǎng)前，需對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理，要將所有的微生物殺死；當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落,來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌；土壤中各類(lèi)微生物的數(shù)量是不同的,為獲得不同類(lèi)型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離,同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。當(dāng)堂檢測(cè)1．原油泄漏是當(dāng)今重要的環(huán)境問(wèn)題，應(yīng)用微生物處理泄漏原油是消除石油污染的有效措施，欲獲得原油分解菌,應(yīng)到哪里中尋找?（）A．淡水湖B．農(nóng)田土壤C．油田土壤D．熱泉答案：C解析：要根據(jù)目的菌株對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找.2．在微生物學(xué)中,將允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)又能抑制或者阻止其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基稱(chēng)作()。A．鑒別培養(yǎng)基B．加富培養(yǎng)基C．選擇培養(yǎng)基D．基礎(chǔ)培養(yǎng)基答案：C解析：基礎(chǔ)培養(yǎng)基是含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，例如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；加富培養(yǎng)基一般用來(lái)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物；鑒別培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種特殊的化學(xué)物質(zhì)，微生物的代謝產(chǎn)物能與該物質(zhì)產(chǎn)生特定的化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生明顯的特征變化，如出現(xiàn)某種特定顏色等，從而鑒別出微生物種類(lèi)；選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)，促進(jìn)需要的微生物生長(zhǎng)、抑制不需要的微生物生長(zhǎng)，從而選擇出某種微生物.3．下列不屬于統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目方法的是（)。A．顯微鏡直接計(jì)數(shù)法B．活菌計(jì)數(shù)法C．濾膜法D．標(biāo)志重捕法答案：D解析：標(biāo)志重捕法是調(diào)查活動(dòng)能力強(qiáng)、活動(dòng)范圍大的動(dòng)物的種群密度的方法。4．測(cè)定土壤中不同微生物的數(shù)量，要選用不同倍數(shù)的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，請(qǐng)選出培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)所用的稀釋倍數(shù)(）.①10②102③103④104⑤105⑥106A．①②③B．②③④C．③④⑤D．④⑤⑥答案：D解析：土壤中細(xì)菌的數(shù)量非常多,一般選取的