DB32T-從業(yè)人員健康檢查 第4部分：重要腸道傳染病致病微生物檢驗方法

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h\t"標(biāo)準(zhǔn)文件_一級條標(biāo)題,2,標(biāo)準(zhǔn)文件_附錄一級條標(biāo)題,2,"前言 II引言 III1范圍 IV2規(guī)范性引用文件 IV3術(shù)語和定義 IV4原理（方法） V5設(shè)備與材料 V6培養(yǎng)基和試劑 VI7檢驗程序 VI8操作步驟 VII附錄A（規(guī)范性）傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴熒光PCR檢測反應(yīng)體系及注意事項 13附錄B（規(guī)范性）標(biāo)本混合方案 15前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB32/T4644《從業(yè)人員健康檢查》的第4部分。DB32/T4644已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：檢查機構(gòu)管理規(guī)范；——第2部分：健康檢查技術(shù)規(guī)范。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會提出。本文件由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、南京市疾病預(yù)防控制中心、徐州市疾病預(yù)防控制中心、赤峰眾康生物科技有限公司。本文件主要起草人：霍翔、李曄、喬昕、王燕梅、馬愷、徐光、朱寶立、韓磊、李亞波、郭寶福、苗升浩。引言從業(yè)人員健康檢查是根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》《中華人民共和國食品安全法》《中華人民共和國藥品管理法》《公共場所衛(wèi)生管理條例》《生活飲用水衛(wèi)生監(jiān)督管理辦法》《化妝品衛(wèi)生管理條例》等法律法規(guī)所進行的從業(yè)前、從業(yè)期間的健康檢查。DB32/T4644《從業(yè)人員健康檢查》擬分為以下5個部分?！?部分：檢查機構(gòu)管理規(guī)范；——第2部分：健康檢查技術(shù)規(guī)范；——第3部分：質(zhì)量控制規(guī)范；——第4部分：重要腸道傳染病致病微生物檢驗方法；——第5部分：信息系統(tǒng)基本數(shù)據(jù)集。DB32/T4644的制定是對從業(yè)人員健康檢查工作相關(guān)方面的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有力補充，為貫徹落實《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》，推進健康中國建設(shè)，提高人民健康水平，保障公眾健康和公共衛(wèi)生安全具有非常重要的意義。從業(yè)人員健康檢查第4部分：重要腸道傳染病致病微生物檢驗方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了從業(yè)人員健康檢查糞便標(biāo)本（肛拭子）中傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴等重要腸道傳染病致病微生物的檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于公共場所從業(yè)人員、食品生產(chǎn)和加工（食品生產(chǎn)）人員、食品流通和餐飲服務(wù)（食品經(jīng)營）人員、飲用水生產(chǎn)、經(jīng)營人員健康檢查項目中，糞便標(biāo)本（肛拭子）的傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的檢驗。其他相關(guān)行業(yè)從業(yè)人員，如從事醫(yī)療衛(wèi)生用品生產(chǎn)、經(jīng)營人員以及化妝品生產(chǎn)人員等，健康檢查項目中，糞便標(biāo)本（肛拭子）的傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、志賀氏菌、霍亂弧菌和痢疾阿米巴檢驗可參照本標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗GB4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求 WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用WS280 傷寒和副傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)WS287 細(xì)菌性和阿米巴性痢疾診斷標(biāo)準(zhǔn)WS289霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。實時熒光PCRreal-timePCR實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)。Ct值cyclethreshold每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的闊值時，所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?？s略語下列縮略語適用于本文件。DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid)FAM：6－羧基熒光素（6-carboxyfluorescein) VIC：琥珀酰亞胺酯CY5：磺酸基-CY5羧酸LDC：賴氨酸脫羧酶（LysineDecarboxylase)MAC：麥康凱瓊脂（MacConkeyAgar)NB：營養(yǎng)肉湯（NutrientBroth)NP-40：乙基苯基聚乙二醇（NonidetP-40)SC：亞硒酸鹽胱氨酸（SeleniteCystine)Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase)TSI：三糖鐵瓊脂（TripleSugarIronAgar)UNG酶：尿嘧啶DNA糖基酶（UracilDNAglycosylase)BS：亞硫酸鉍瓊脂XLD：木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（Xylose-LysineDesoxycholate)TCBS:硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂原理（方法）篩查試驗依據(jù)核酸體外擴增基本原理，針對傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴特異靶基因序列設(shè)計引物、熒光標(biāo)記探針，在PCR反應(yīng)過程中，當(dāng)熒光信號達(dá)到并超過所設(shè)定的閾值時，利用熒光信號強度與PCR產(chǎn)物量的正相關(guān)關(guān)系，即可對PCR結(jié)果進行分析和判定。對標(biāo)本的模板DNA進行實時熒光PCR擴增，根據(jù)其Ct值及擴增曲線進行標(biāo)本結(jié)果報告，當(dāng)PCR結(jié)果呈陰性時直接報告陰性結(jié)果；當(dāng)PCR結(jié)果呈陽性時，進一步對陽性標(biāo)本做確診實驗。從而實現(xiàn)對從業(yè)人員健康檢查糞便標(biāo)本中的傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的快速篩查。確證鑒定確證鑒定的基本原理，是通過增菌、分離、生化和血清學(xué)鑒定等方法，從PCR陽性標(biāo)本中分離得到目標(biāo)致病性微生物。確證鑒定結(jié)果為陽性時報告陽性（檢出），為陰性時報告陰性（未檢出）。設(shè)備與材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備材料如下生物安全柜。高速離心機（離心速度12000r/min以上）。渦旋混勻器。恒溫培養(yǎng)箱。冰箱：2℃～8℃和-20℃電子天平：感量1mg。恒溫金屬?。″仯?5℃～100℃。pH計或pH比色管或精pH試紙。微量可調(diào)移液器和配套帶濾芯吸頭：2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。采樣管：密閉式，內(nèi)徑≥1.2cm，高度≥10cm。采樣拭子：長度≥10cm。無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。無菌試管：3mm×50mm。無菌錐形瓶：容量500mL,250mL。實時熒光PCR儀。全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。培養(yǎng)基和試劑營養(yǎng)肉湯（NB）增菌液。亞硫酸鉍（BS）瓊脂。木糖賴氨酸脫氧膽酸（XLD）瓊脂。沙門菌顯色培養(yǎng)基。麥康凱瓊脂（MAC）。三糖鐵瓊脂（TSI）。四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液。亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液。克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）。糖發(fā)酵管。賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基（LDC）。動力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂。靛基質(zhì)試劑。沙門菌屬診斷血清。志賀菌屬診斷血清。除特別說明外，PCR所用試劑為分析純。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。DNA提取液：Tris-EDTA緩沖液（0.01mol/L,pH8.0）、0.01%NP40。實時熒光PCR檢測試劑：傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴熒光PCR檢測靶基因、反應(yīng)體系及注意事項見附錄A。堿性蛋白胨水培養(yǎng)基。慶大霉素瓊脂。TCBS瓊脂。四號瓊脂。堿性營養(yǎng)瓊脂。氧化酶試劑?；魜y弧菌診斷血清。檢驗程序從業(yè)人員健康檢查重要腸道傳染病致病微生物檢驗程序見圖1。從業(yè)人員健康檢查重要腸道傳染病致病菌檢驗程序操作步驟標(biāo)本采集、保存及運輸標(biāo)本采集用滅菌的采樣拭子，由肛門插入直腸內(nèi)3cm-5cm處，旋轉(zhuǎn)360°采集，或用采樣拭子蘸取糞便，放入盛有5-10mL營養(yǎng)肉湯增菌液的采樣管內(nèi)，旋緊管蓋，編號備用。標(biāo)本的保存和運輸采集的標(biāo)本盡快運送到實驗室，如不能立即送檢，在2℃-8℃條件下保存不超過24h。標(biāo)本的前處理前增菌采集的肛拭子標(biāo)本，需要在營養(yǎng)肉湯中置于36°C±1℃增菌培養(yǎng)3h-6h。標(biāo)本混合模板DNA的制備標(biāo)本12000r/min離心5min，棄盡上清；加入50μL-100μLDNA提取液，重懸沉淀并充分混合后100℃加熱處理5min,12000r/min離心2min，取5μL上清液，作為模板DNA用于實時熒光PCR檢測（制備好的裂解液需立即進行實時熒光PCR檢測）。篩查試驗（實時熒光PCR)試劑配制按照附錄A配制傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴熒光PCR檢測反應(yīng)體系。實時熒光PCR快速檢測過程防污染方法和措施按照WS/T230-2002第6章進行。分裝體系制取的n管標(biāo)本加上陽性對照和陰性對照各一管，按附錄A體系要求分裝反應(yīng)液（20μL)。加樣在標(biāo)本處理區(qū)取n+2管（為待檢混合管管數(shù)n+一管陽性對照+一管陰性對照）分裝好反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管。先瞬間離心10s，再將對應(yīng)編號的PCR反應(yīng)管加入5μL上清液，蓋緊管蓋，瞬間離心10s。熒光PCR檢測在核酸擴增區(qū)進行。將8.3.3中離心后的PCR反應(yīng)管放入實時熒光PCR儀內(nèi)，記錄標(biāo)本擺放順序，進行核酸擴增和檢測。反應(yīng)體系為25μL，其中PCR反應(yīng)液（含有特異性引物、dNTP、探針及反應(yīng)所需各種離子）19.64μL,UNG酶0.06μL(lU/μL),Taq酶0.3μL(5U/μL)，模板DNA5μL。熒光PCR檢測的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：第一階段，UNG酶處理50℃／2min,1個循環(huán)；第二階段，預(yù)變性95℃／2min,1個循環(huán)；第三階段，95℃／5s,60℃／30s,40個循環(huán)。在該階段的60℃/30s采集FAM、VIC和CY5熒光信號。如用商品化實時熒光PCR試劑盒，應(yīng)按照試劑盒說明書進行操作和結(jié)果判定。結(jié)果判斷結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準(zhǔn)，不同儀器可根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對照：Ct＞36或無Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期。陽性對照：Ct≤22，曲線有明顯指數(shù)擴增期。如果陰性對照和陽性對照的熒光PCR檢測結(jié)果不能滿足以上條件，此次實驗視為無效。結(jié)果判定和報告FAM通道Ct值＞36或無Ct值，可判定標(biāo)本檢測結(jié)果為傷寒沙門菌(A管)和（或）痢疾阿米巴(B管)陰性，可直接報告未檢出傷寒沙門菌和（或）痢疾阿米巴；VIC通道Ct值＞36或無Ct值，可判定標(biāo)本檢測結(jié)果為副傷寒沙門菌(A管)陰性，可直接報告未檢出副傷寒沙門菌；CY5通道Ct值＞36或無Ct值，可判定標(biāo)本檢測結(jié)果為霍亂弧菌(A管)和志賀氏菌(B管)陰性，可直接報告未檢出霍亂弧菌和（或）志賀氏菌。FAM通道Ct值<33，有明顯指數(shù)增長期，可判定該標(biāo)本檢測結(jié)果為傷寒沙門菌(A管)和（或）痢疾阿米巴(B管)；VIC通道Ct值<33，有明顯指數(shù)增長期，可判定該標(biāo)本檢測結(jié)果為副傷寒沙門菌(A管)；CY5通道Ct值<33，有明顯指數(shù)增長期，可判定該標(biāo)本檢測結(jié)果為霍亂弧菌(A管)和（或）志賀氏菌(B管)。如表1。FAMVICCY5A管傷寒沙門菌副傷寒沙門菌霍亂弧菌B管痢疾阿米巴/志賀氏菌FAM通道、VIC通道和（或）CY5通道33≤Ct值≤36，建議標(biāo)本重新做熒光PCR檢測。如果重新檢測結(jié)果的Ct值≤36，曲線有明顯指數(shù)增長期，則判定為相應(yīng)病原體陽性，否則判定為陰性。PCR陽性混合標(biāo)本確認(rèn)對PCR結(jié)果為陽性的混合標(biāo)本，依據(jù)8.5確診試驗做進一步的確認(rèn)。確證鑒定增菌混合標(biāo)本PCR檢測結(jié)果為傷寒或副傷寒沙門氏菌陽性時，將標(biāo)本分別接種于SC增菌液中36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h,TTB增菌液中42℃±1℃培養(yǎng)18h-24h?；旌蠘?biāo)本PCR檢測結(jié)果為志賀氏菌陽性時，無需增菌，將標(biāo)本直接分離培養(yǎng)。混合標(biāo)本PCR檢測結(jié)果為霍亂弧菌陽性時，將標(biāo)本接種于堿性蛋白胨水培養(yǎng)基中37℃增菌培養(yǎng)6h-8h?；旌蠘?biāo)本PCR檢測結(jié)果為痢疾阿米巴陽性時，需重新采集病人糞便，按照WS287進行檢驗。分離培養(yǎng)傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌：按照GB4789.4進行檢測。志賀氏菌：取前增菌液1環(huán)，劃線接種于MAC或XLD瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h，志賀氏菌呈現(xiàn)不發(fā)酵乳糖的菌落，見表2。志賀菌屬在MAC和XLD瓊脂平板上的菌落特征霍亂弧菌：取增菌液1環(huán)，劃線接種于強、弱選擇性培養(yǎng)基各一個置37℃培養(yǎng)18h～24h。強選擇性培養(yǎng)基包括慶大霉素瓊脂、TCBS瓊脂和四號瓊脂。弱選擇性培養(yǎng)基一般使用堿性營養(yǎng)瓊脂?；魜y弧菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征見表3.霍亂弧菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征選擇性瓊脂平板霍亂弧菌堿性營養(yǎng)瓊脂無色、圓形、透明或半透明、表面光滑、潤濕、扁平或和稍凸起、邊緣整齊，菌落直徑一般約為2mm。慶大霉素瓊脂和四號瓊脂與堿性營養(yǎng)瓊脂上生長的菌落相似，但透明性略差，多呈半透明狀，由于這類培養(yǎng)基均含有亞碲酸鹽成分，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養(yǎng)時間的延長而加深。TCBS瓊脂黃色發(fā)亮、表面光滑、潤濕、稍凸起、邊緣整齊生化試驗傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌按照GB4789.4進行檢測。志賀氏菌按照WS287進行檢測?？蛇x擇鑒定試劑盒或全自動微生物鑒定系統(tǒng)?；魜y弧菌菌株初篩包括玻片凝集實驗、氧化酶試驗。玻片凝集實驗a)從分離培養(yǎng)基上挑取疑似菌落接種于非選擇性培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)(37℃18h～24h),取純培養(yǎng)物與O1群霍亂弧菌診斷用單克隆抗體或O1群多價診斷血清及O139群霍亂弧菌診斷用單克隆抗體或診斷血清做玻片凝集試驗，進行O1群和O139群霍亂弧菌的初篩。b)玻片凝集試驗使用的血清效價范圍應(yīng)為1:32～1:64。如玻片凝集試驗在1min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集塊，但在生理鹽水中不產(chǎn)生凝集的培養(yǎng)菌判為凝集陽性；應(yīng)立即保存菌株做復(fù)核與分型鑒定；在1min內(nèi)不出現(xiàn)凝集塊者判為凝集陰性。c)生長在堿性營養(yǎng)瓊脂、慶大霉素瓊脂及四號瓊脂上的疑似菌落如足夠大，可直接挑取疑似菌落與O1群霍亂弧菌多價診斷血清及O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗進行初篩。但生長在TCBS培養(yǎng)基上的疑似菌落常因培養(yǎng)基中蔗糖的影響造成難于乳化，不能直接進行玻片凝集試驗，應(yīng)先以非選擇性培養(yǎng)基純培養(yǎng)后再作玻片凝集。d)要注意同一標(biāo)本存在O1群和O139群等多個血清群霍亂弧菌混合的可能，每份標(biāo)本至少挑選5個以上的疑似菌落逐一進行鑒定。氧化酶試驗試驗方法：取生長在非選擇性培養(yǎng)基上的新鮮培養(yǎng)物涂抹在清潔的濾紙上，然后滴加氧化酶試劑，如培養(yǎng)物在1min～2min內(nèi)出現(xiàn)粉紅-紫紅-紫藍(lán)色，有的最后呈紫黑色，判斷為氧化酶試驗陽性；培養(yǎng)物不顯色判為陰性。菌株復(fù)核經(jīng)初篩陽性或可疑陽性的菌株，應(yīng)該進行復(fù)核鑒定。復(fù)核結(jié)果符合O1群或O139群霍亂弧菌的菌株，按菌株管理的要求進行保存與上送；如復(fù)核結(jié)果出現(xiàn)疑問，應(yīng)盡快將菌株上送參比實驗室進行確認(rèn)分析。菌株的復(fù)核鑒定應(yīng)以純培養(yǎng)物為基礎(chǔ)，至少應(yīng)包括以下項目：血清凝集試驗與血清分型、革蘭染色、黏絲試驗、氧化酶試驗、動力試驗?；魜y弧菌系統(tǒng)生化鑒定詳見表4。部分弧菌科細(xì)菌的系統(tǒng)生化鑒定注：部分O139群霍亂弧菌為抗性(R)可選擇鑒定試劑盒或全自動微生物鑒定系統(tǒng)。菌株鑒定根據(jù)以上傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、志賀氏菌的初步生化反應(yīng)結(jié)果，依據(jù)GB4789.4和WS287做進一步菌株鑒定。血清學(xué)分型傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、志賀氏菌采用玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙型菌株，不能分型。傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌血清分型按照GB4789.4進行檢測。志賀氏菌血清分型按照WS287附錄A.1進行檢測。PCR檢測結(jié)果為痢疾阿米巴陽性時，按照WS287附錄A.2進行檢測。結(jié)果報告根據(jù)確診試驗結(jié)果對實時熒光PCR陽性標(biāo)本作出最終結(jié)果判定和菌型判定。

（規(guī)范性）

傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴熒光PCR檢測反應(yīng)體系及注意事項A.1 熒光PCR檢測靶基因分別針對傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的特異基因設(shè)計引物和探針，引物和探針序列見表A.l。傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌等病原體特異性引物和探針5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5