免疫學檢驗技術-免疫細胞及其功能檢驗技術

知識目標1.掌握：單個核細胞和淋巴細胞及其亞群的分離純化；T細胞及其亞群的表面標志和功能檢測方法；B細胞功能檢測方法和原理；NK細胞的表面標志。2.熟悉：NK細胞功能的檢測方法和原理。3.了解：中性粒細胞、巨噬細胞功能檢測方法和原理。能力目標掌握密度梯度離心法分離外周血單個核細胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細胞及其亞群的操作方法。思政-素質目標責任心、質控、生物安全意識、臨床免疫學思維教學目標目錄免疫細胞的分離與純化一淋巴細胞數量及功能檢測二吞噬細胞功能檢測三免疫細胞是指參與免疫應答或與免疫應答相關的細胞，主要包括淋巴細胞、單核-巨噬細胞和樹突狀細胞等。通過分離、純化免疫細胞及其亞群，并對其數量和功能測定，可以判斷機體免疫功能狀態(tài)，對指導臨床實踐和科學研究具有重要意義。前言第一節(jié)免疫細胞的分離與純化免疫細胞的分離方法很多，主要根據細胞表面標志、理化性狀和細胞功能等特征。應根據實驗目的、所分離的目的細胞群種類、數量和純度等要求選擇分離方法。所用的方法應力求操作簡便、盡量保持細胞活性兼顧細胞純度和獲得率。一、白細胞的分離（一）自然沉降法加抗凝血于試管中室溫或37℃中靜置（30-60min）分層結果示意圖（二）高分子聚合物沉降法抗凝血與等量3%明膠或6%右旋糖酐溶液混勻室溫或37℃中靜置（30～60min）分層結果與自然沉降法類似優(yōu)點：速度快、得率高不足：白細胞黏性增加二、外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）主要是指淋巴細胞和單核細胞。PBMC是免疫學實驗中最常用的細胞群PBMC也是T、B細胞分離純化的細胞來源。細胞種類密度紅細胞1.093白細胞1.092淋巴細胞和單核細胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各類血細胞密度常用的分離液：Ficoll液和Percoll液尤以密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll液）最常用。（一）

Ficoll分離法注意：溫度以20℃最適宜，超過25℃影響細胞得率（二）

Percoll分層液法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min結果示意圖三、淋巴細胞的純化及亞群的分離采用Ficoll和Percoll分離法獲得的細胞懸液成分仍然較為復雜、均一性不佳。通常需要進一步分離純化淋巴細胞及其亞群。分離原理主要基于細胞的表面標志和功能等性質。淋巴細胞及其亞類的分離純化是免疫學檢驗與研究的重要基礎技術。（一）淋巴細胞的純化去除紅細胞：低滲裂解法、氯化銨裂解法。去除血小板：多次洗滌離心法、胎牛血清梯度離心法。去除單核細胞：黏附法、羧基鐵吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法（二）淋巴細胞的分離E花環(huán)沉降法該法簡便易行，主要用于T細胞的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細胞并低滲裂解（二）淋巴細胞的分離尼龍棉分離法該法簡單快速，可分離T細胞和B細胞PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時預熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫獲得T細胞冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓獲得B細胞（二）淋巴細胞的分離免疫磁珠分離法（二）淋巴細胞的分離流式細胞術分離法該法快速、細胞純度和獲得率高，可分離各種淋巴細胞及其亞群。四、吞噬細胞的分離吞噬細胞包括兩類：一類是大吞噬細胞即單核吞噬細胞系統(tǒng)（包括血液中的單核細胞以及組織器官中的巨噬細胞）；另一類是小吞噬細胞，即中性粒細胞。分離原理：主要根據其表面標志和生物學特性。（一）單核細胞的分離Percoll密度梯度分離法流式細胞術分離法（常用方法）免疫磁珠分離法：分選CD14+細胞（常用方法）黏附法黏附法會影響單核細胞的功能，僅適用于去除單核細胞。（二）巨噬細胞的分離斑蝥敷貼法：（用于分離人巨噬細胞）

操作要點：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的濾紙?zhí)笤谇氨蹆葌绕つw，4~5小時后見皮膚局部充血，48小時后出現水泡，吸取滲出液（主要為巨噬細胞）、離心洗滌。腹腔滲出液分離法：（用于分離動物巨噬細胞）

操作要點：少量液體石蠟注入動物腹腔內，3~4天后沖洗出腹腔滲出液（70%~80%為巨噬細胞）。（三）中性粒細胞的分離右旋糖酐沉降法：

操作要點：抗凝靜脈血與6%右旋糖酐溶液按比例混合，室溫條件垂直靜置一定時間后，紅細胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白細胞沉降速度慢位于上層，獲取上層細胞。第二節(jié)淋巴細胞數量及功能檢測許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細胞數量和功能變化。數量檢測：根據淋巴細胞及其亞群的表面標志。功能測定：包括體內試驗和體外試驗。一、T細胞數量及功能檢測（一）T細胞的數量檢測根據T細胞表面CD分子檢測：（1）間接熒光免疫法（2）免疫組織化學法：①酶標（ABC法、APAAP法）②金標法（即IGSS法）間接熒光免疫法（二）T細胞功能檢測T細胞增殖試驗：形態(tài)學法、3H-TdR摻入法、MTT法CTL介導的細胞毒試驗：51Cr釋放法抗原特異性T細胞定量檢測：MHC-抗原肽四聚體技術淋巴細胞內細胞因子檢測：流式細胞術體內試驗：結核菌素試驗、PHA皮膚試驗PBMCPHA5％CO2、

37℃培養(yǎng)72h細胞涂片染色顯微鏡檢查該法簡便易行、容易在基層推廣，但主觀因素影響大。形態(tài)學法T細胞增殖試驗未轉化淋巴細胞轉化的淋巴母細胞轉化率（％）＝轉化的淋巴細胞數計數的淋巴細胞總數X100％培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞抗凝全血分離液離心過濾測量放射性3H-TdR摻入法靈敏度高客觀性好原理：外周血T細胞

PHA發(fā)生增殖

MTT含藍色甲顆粒的T細胞

MTT

PHA有機溶劑測吸光度（A）值

計算SI判定細胞增殖結果(SI≧2具有意義)MTT法操作簡便無放射污染51Cr釋放法淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr釋放測定γ射線CTL介導的細胞毒試驗原理根據T細胞活化的雙識別原理，用生物工程技術將MHC分子在體外組裝，并結合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復合物，結合流式細胞儀定量檢測抗原特異性T細胞。TMHC-抗原肽四聚體技術MHC-肽四聚體技術淋巴細胞內細胞因子檢測實驗原理:用刺激劑體外激活淋巴細胞，用蛋白轉運抑制劑如莫能霉素阻止細胞因子分泌到細胞外，細胞內蛋白質轉運方式被打亂，引起細胞因子向高爾基體積聚，用流式細胞儀測定淋巴細胞內的細胞因子種類，確定Th1/Th2細胞的百分率。分泌的細胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++Thl和Th2分泌的細胞因子二、B細胞數量及功能檢測（一）B細胞數量檢測根據B細胞表面標志進行檢測：（1）mIg的檢測：免疫熒光、免疫組化（2）

CD分子的檢測：檢測CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠紅細胞受體的檢測：花環(huán)試驗（二）B細胞功能檢測B細胞增殖試驗：3H-TdR摻入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黃色葡萄球菌菌體或抗IgM抗體）B細胞抗體產生能力檢測：溶血空斑試驗、ELISPOT經典溶血空斑試驗1.SRBC致敏的B細胞與SRBC在凝膠介質中混勻；2.抗體形成細胞(Antibodyformingcell,AFC)周圍的SRBC與AFC產生的抗體結合而被致敏；3.加入豚鼠新鮮補體，致敏SRBC激活補體而溶解，在AFC周圍出現肉眼可見的溶血空斑；4.計算溶血空斑的數目。溶血空斑試驗酶聯免疫斑點試驗抗體產生B細胞抗原包被酶聯抗抗體凝膠底物顯色可在單細胞水平上檢測B產生抗體和T細胞分泌細胞因子三、NK細胞數量及功能檢測（一）NK細胞數量檢測根據NK細胞表面標志進行檢測：

CD分子的檢測：檢測CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）

（二）NK細胞功能檢測形態(tài)學法酶釋法：LDH釋放法熒光法：時間分辨熒光免疫分析法放射性核素釋放法：51Cr釋放法、125I-UdR釋放法流式細胞術：PI染色NK靶細胞檢測熒光強度、cpm等K562細胞為人NK細胞殺傷功能檢測的常用靶細胞第三節(jié)吞噬細胞功能檢測一、中性粒細胞功能檢測趨化功能檢測：體內法（也稱皮膚窗口法）體外法（濾膜滲透法/

Boyden小室法、瓊脂糖平板法）吞噬功能檢測：（吞噬金黃色葡萄球菌或白色念珠菌）殺傷功能檢測：

溶菌法、硝基藍四氮唑（NBT）還原試驗體內實驗法--皮膚窗口法在受檢者前臂屈側中央3㎜范圍內，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時各取樣一次，染色觀察中性粒細胞聚集開始時間、聚集程度等。健康正常人一般2～3小時后開始聚集，達50～100個，6小時可達1000個以上。（一）中性粒細胞趨化功能檢測體外法--Boyden小室法Boyden小室體外法--瓊脂糖平板法原理及技術要點

在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對照液，溫育4～8小時后，用顯微鏡測微器測定中性粒細胞向左孔的移動距離A和向右孔的移動距離B，計算趨化指數。趨化指數越大運動能力越強將細胞懸液與金黃色葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合，溫育后涂片、固定和染色。在油鏡下觀察中性粒細胞對細菌的吞噬情況，計數100個細胞中吞噬和未吞噬細菌的中性粒細胞數，并記錄吞噬的細菌數。（二）中性粒細胞吞噬功能檢測（三）中性粒細胞殺傷功能檢測硝基藍四氮唑（NBT）還原試驗

方法：1.抗凝血+硝基藍四氮唑（NBT），溫育25min；2.推片染色、鏡檢（含甲臜顆粒的中性粒細胞）。正常值：NBT陽性細胞率應7%~15%二、巨噬細胞功能檢測炭粒廓清試驗：主要用于動物實驗吞噬功能檢測：（吞噬雞紅細胞或白假絲酵母等）促凝血活性測定：正常小鼠肝中庫普弗細胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除10％炭粒。據此給小鼠靜脈注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時間反復取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細胞的功能。主要用于動物實驗（一）炭粒廓清試驗（二）巨噬細胞吞噬功能檢測巨噬細胞雞紅細胞或白假絲酵母＋孵育涂片染色鏡檢計算吞噬率和吞噬指數小結Ficoll單次密度梯度離心法分離外周血單個核細胞；流式細胞術和磁珠分離法進行細胞分離和數量檢測；淋巴細胞增殖試驗：常用MTT法和3H-TdR摻入法；細胞功能檢測：T細胞（增殖、殺傷、胞內細胞因子等），B細胞（增殖、分泌抗體能力），NK（殺傷），中性粒細胞（趨化、吞噬、殺傷），巨噬細胞（吞噬功能--炭粒廓清、雞紅細胞吞噬實驗）知識目標1.掌握：單個核細胞和淋巴細胞及其亞群的分離純化；T細胞及其亞群的表面標志和功能檢測方法；B細胞功能檢測方法和原理；NK細胞的表面標志。2.熟悉：NK細胞功能的檢測方法和原理。3.了解：中性粒細胞、巨噬細胞功能檢測方法和原理。能力目標掌握密度梯度離心法分離外周血單個核細胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細胞及其亞群的操作方法。思政-素質目標責任心、質控、生物安全意識、臨床免疫學思維教學目標目錄免疫細胞的分離與純化一淋巴細胞數量及功能檢測二吞噬細胞功能檢測三免疫細胞是指參與免疫應答或與免疫應答相關的細胞，主要包括淋巴細胞、單核-巨噬細胞和樹突狀細胞等。通過分離、純化免疫細胞及其亞群，并對其數量和功能測定，可以判斷機體免疫功能狀態(tài)，對指導臨床實踐和科學研究具有重要意義。前言免疫細胞的分離方法很多，主要根據細胞表面標志、理化性狀和細胞功能等特征。應根據實驗目的、所分離的目的細胞群種類、數量和純度等要求選擇分離方法。所用的方法應力求操作簡便、盡量保持細胞活性兼顧細胞純度和獲得率。免疫細胞的分離與純化一一、白細胞的分離（一）自然沉降法加抗凝血于試管中室溫或37℃中靜置（30-60min）分層結果示意圖（二）高分子聚合物沉降法抗凝血與等量3%明膠或6%右旋糖酐溶液混勻室溫或37℃中靜置（30～60min）分層結果與自然沉降法類似優(yōu)點：速度快、得率高不足：白細胞黏性增加二、外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）主要是指淋巴細胞和單核細胞。PBMC是免疫學實驗中最常用的細胞群PBMC也是T、B細胞分離純化的細胞來源。細胞種類密度紅細胞1.093白細胞1.092淋巴細胞和單核細胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各類血細胞密度常用的分離液：Ficoll液和Percoll液尤以密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll液）最常用。（一）

Ficoll分離法注意：溫度以20℃最適宜，超過25℃影響細胞得率（二）

Percoll分層液法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min結果示意圖三、淋巴細胞的純化及亞群的分離采用Ficoll和Percoll分離法獲得的細胞懸液成分仍然較為復雜、均一性不佳。通常需要進一步分離純化淋巴細胞及其亞群。分離原理主要基于細胞的表面標志和功能等性質。淋巴細胞及其亞類的分離純化是免疫學檢驗與研究的重要基礎技術。（一）淋巴細胞的純化去除紅細胞：低滲裂解法、氯化銨裂解法。去除血小板：多次洗滌離心法、胎牛血清梯度離心法。去除單核細胞：黏附法、羧基鐵吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法（二）淋巴細胞的分離E花環(huán)沉降法該法簡便易行，主要用于T細胞的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細胞并低滲裂解（二）淋巴細胞的分離尼龍棉分離法該法簡單快速，可分離T細胞和B細胞PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時預熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫獲得T細胞冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓獲得B細胞（二）淋巴細胞的分離免疫磁珠分離法（二）淋巴細胞的分離流式細胞術分離法該法快速、細胞純度和獲得率高，可分離各種淋巴細胞及其亞群。四、吞噬細胞的分離吞噬細胞包括兩類：一類是大吞噬細胞即單核吞噬細胞系統(tǒng)（包括血液中的單核細胞以及組織器官中的巨噬細胞）；另一類是小吞噬細胞，即中性粒細胞。分離原理：主要根據其表面標志和生物學特性。（一）單核細胞的分離Percoll密度梯度分離法流式細胞術分離法（常用方法）免疫磁珠分離法：分選CD14+細胞（常用方法）黏附法黏附法會影響單核細胞的功能，僅適用于去除單核細胞。（二）巨噬細胞的分離斑蝥敷貼法：（用于分離人巨噬細胞）

操作要點：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的濾紙?zhí)笤谇氨蹆葌绕つw，4~5小時后見皮膚局部充血，48小時后出現水泡，吸取滲出液（主要為巨噬細胞）、離心洗滌。腹腔滲出液分離法：（用于分離動物巨噬細胞）

操作要點：少量液體石蠟注入動物腹腔內，3~4天后沖洗出腹腔滲出液（70%~80%為巨噬細胞）。（三）中性粒細胞的分離右旋糖酐沉降法：

操作要點：抗凝靜脈血與6%右旋糖酐溶液按比例混合，室溫條件垂直靜置一定時間后，紅細胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白細胞沉降速度慢位于上層，獲取上層細胞。知識目標1.掌握：單個核細胞和淋巴細胞及其亞群的分離純化；T細胞及其亞群的表面標志和功能檢測方法；B細胞功能檢測方法和原理；NK細胞的表面標志。2.熟悉：NK細胞功能的檢測方法和原理。3.了解：中性粒細胞、巨噬細胞功能檢測方法和原理。能力目標掌握密度梯度離心法分離外周血單個核細胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細胞及其亞群的操作方法。思政-素質目標責任心、質控、生物安全意識、臨床免疫學思維教學目標目錄免疫細胞的分離與純化一淋巴細胞數量及功能檢測二吞噬細胞功能檢測三許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細胞數量和功能變化。數量檢測：根據淋巴細胞及其亞群的表面標志。功能測定：包括體內試驗和體外試驗。免疫細胞的分離與純化二一、T細胞數量及功能檢測（一）T細胞的數量檢測根據T細胞表面CD分子檢測：（1）間接熒光免疫法（2）免疫組織化學法：①酶標（ABC法、APAAP法）②金標法（即IGSS法）間接熒光免疫法（二）T細胞功能檢測T細胞增殖試驗：形態(tài)學法、3H-TdR摻入法、MTT法CTL介導的細胞毒試驗：51Cr釋放法抗原特異性T細胞定量檢測：MHC-抗原肽四聚體技術淋巴細胞內細胞因子檢測：流式細胞術體內試驗：結核菌素試驗、PHA皮膚試驗PBMCPHA5％CO2、

37℃培養(yǎng)72h細胞涂片染色顯微鏡檢查該法簡便易行、容易在基層推廣，但主觀因素影響大。形態(tài)學法T細胞增殖試驗未轉化淋巴細胞轉化的淋巴母細胞轉化率（％）＝轉化的淋巴細胞數計數的淋巴細胞總數X100％培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞抗凝全血分離液離心過濾測量放射性3H-TdR摻入法靈敏度高客觀性好原理：外周血T細胞

PHA發(fā)生增殖

MTT含藍色甲顆粒的T細胞

MTT

PHA有機溶劑測吸光度（A）值

計算SI判定細胞增殖結果(SI≧2具有意義)MTT法操作簡便無放射污染51Cr釋放法淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr釋放測定γ射線CTL介導的細胞毒試驗原理根據T細胞活化的雙識別原理，用生物工程技術將MHC分子在體外組裝，并結合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復合物，結合流式細胞儀定量檢測抗原特異性T細胞。TMHC-抗原肽四聚體技術MHC-肽四聚體技術淋巴細胞內細胞因子檢測實驗原理:用刺激劑體外激活淋巴細胞，用蛋白轉運抑制劑如莫能霉素阻止細胞因子分泌到細胞外，細胞內蛋白質轉運方式被打亂，引起細胞因子向高爾基體積聚，用流式細胞儀測定淋巴細胞內的細胞因子種類，確定Th1/Th2細胞的百分率。分泌的細胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++Thl和Th2分泌的細胞因子二、B細胞數量及功能檢測（一）B細胞數量檢測根據B細胞表面標志進行檢測：（1）mIg的檢測：免疫熒光、免疫組化（2）

CD分子的檢測：檢測CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠紅細胞受體的檢測：花環(huán)試驗（二）B細胞功能檢測B細胞增殖試驗：3H-TdR摻入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黃色葡萄球菌菌體或抗IgM抗體）B細胞抗體產生能力檢測：溶血空斑試驗、ELISPOT經典溶血空斑試驗1.SRBC致敏的B細胞與SRBC在凝膠介質中混勻；2.抗體形成細胞(Antibodyformingcell,AFC)周圍的SRBC與AFC產生的抗體結合而被致敏；3.加入豚鼠新鮮補體，致敏SRBC激活補體而溶解，在AFC周圍出現肉眼可見的溶血空斑；4.計算溶血空斑的數目。溶血空斑試驗酶聯免疫斑點試驗抗體產生B細胞抗原包被酶聯抗抗體凝膠底物顯色可在單細胞水平上檢測B產生抗體和T細胞分泌細胞因子三、NK細胞數量及功能檢測（一）NK細胞數量檢測根據NK細胞表面標志進行檢測：

CD分子的檢測：檢測CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）

（二）NK細胞功能檢測形態(tài)學法酶釋法：LDH釋放法熒光法：時間分辨熒光免疫分析法放射性核素釋放法：51Cr釋放法、125I-UdR釋放法流式細胞術：PI染色NK靶細胞檢測熒光強度、cpm等K562細胞為人NK細胞殺傷功能檢測的常用靶細胞知識目標1.掌握：單個核細胞和淋巴細胞及其亞群的分離純化；T細胞及其亞群的表面標志和功能檢測方法；B細胞功能檢測方法和原理；NK細胞的表面標志。2.熟悉：NK細胞功能的檢測方法和原理。3.了解：中性粒細胞、巨噬細胞功能檢測方法和原理。能力目標掌握密度梯度離心法分離外周血單個核細胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細胞及其亞群的操作方法。思政-素質目標責任心、質控、生物安全意識、臨床免疫