免疫學檢驗技術-沉淀反應

知識目標1.掌握：沉淀反應的概念及特點；免疫電泳技術的種類和原理（重點）。2.熟悉：凝膠內沉淀試驗的種類及原理，免疫電泳的應用（重難點）。3.了解：液相沉淀試驗的原理；各種沉淀試驗的技術要點和影響因素；沉淀反應的臨床應用。能力目標掌握：凝膠內沉淀試驗和免疫電泳技術的操作方法熟悉：雙擴和免疫電泳技術的結果判讀和臨床應用思政-素質目標愛崗敬業(yè)、責任心、細心、耐心、質控和生物安全意識、免疫學思維教學目標沉淀反應的概念及特點。液相內沉淀試驗的原理及種類。凝膠內沉淀試驗的原理及種類。雙向瓊脂擴散試驗的應用。凝膠免疫電泳技術的種類及原理。沉淀反應方法的技術要點、影響因素及臨床應用。本章要點沉淀反應概述一液相內沉淀反應二凝膠內沉淀反應三凝膠免疫電泳技術四沉淀反應的臨床應用五目錄沉淀反應（precipitation)

（重點）

可溶性抗原與相應抗體發(fā)生特異性結合，在適當條件下而出現的肉眼可見的沉淀現象。

蛋白質、多糖、血清、類脂等可溶性物質沉淀線或沉淀環(huán)沉淀反應概述一2.免疫沉淀試驗的特點1.階段性第一階段：抗原抗體特異性結合，形成不可見的可溶性免疫復合物。第二階段：形成可見的免疫復合物。2.特異性抗原與相應抗體發(fā)生特異性結合3.抗原性質參與免疫沉淀試驗的抗原必須為可溶性抗原4.抗體的選擇多克隆抗體與抗原多個表位結合，易形成沉淀，故非常適用于免疫沉淀試驗；單克隆抗體只與抗原一個表位結合，不易形成交聯。若抗原表面有兩個以上相同的表位，單克隆抗體也可用于免疫沉淀試驗。3.沉淀反應分類液相內沉淀試驗凝膠內沉淀試驗

凝膠免疫電泳技術

單向瓊脂擴散試驗雙向瓊脂擴散試驗環(huán)狀沉淀反應絮狀沉淀反應免疫比濁度分析對流電泳技術免疫電泳技術火箭電泳技術免疫固定電泳技術環(huán)狀沉淀試驗：抗原溶液疊加在細玻璃管內的抗體液面上，二者在兩液面交界處形成白色沉淀環(huán)。絮狀沉淀試驗：可溶性抗原、抗體在液相中特異性結合，形成絮狀沉淀物。免疫比濁度分析：透射、散射和免疫膠乳比濁法，應用于自動化。液相內沉淀反應二指可溶性抗原、抗體在含有電解質的凝膠內自由擴散形成濃度梯度，二者在比例合適的位置形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。根據抗原與抗體反應的方式和特性，可分為單向瓊脂擴散試驗和雙向瓊脂擴散試驗。凝膠內沉淀反應三

抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關。本法穩(wěn)定、簡便、無需儀器設備。重復性和線性均可信，但靈敏度稍差、耗時長、影響因素多。一、單向瓊脂擴散試驗（平板法）單向免疫擴散試驗將抗原抗體分別加在瓊脂糖凝膠不同的對應孔中，兩者在凝膠中自由擴散，在比例合適處形成白色沉淀線。沉淀線的位置、形狀以及對比關系，可進行定性分析，如抗原或抗體的存在與否、相對含量估計、相對分子量分析和性質分析。本法操作簡單、特異性高、結果可靠、成本低廉，但靈敏度低，耗時長，不能精確定量。二、雙向瓊脂擴散試驗（平板法）1.抗原或抗體的定性分析。2.抗原、抗體的相對分子量和相對濃度的估計。

雙向瓊脂擴散試驗應用A：Ag、Ab濃度及分子量近似；B：Ag、Ab濃度近似，分子量Ag＜Ab；C：Ag、Ab濃度近似，分子量Ag＞Ab；D：濃度Ag＞Ab，分子量近似；E：濃度Ag＞Ab，分子量Ag＜Ab；F：濃度Ag＜Ab，分子量Ag＞Ab抗原完全相同抗原部分相同抗原完全不同3.抗原性質的分析4.抗體效價的測定5.抗原或抗體純度的鑒定電泳分析與沉淀反應的結合產物，即可溶性抗原和抗體在直流電場的作用下，在凝膠內加速定向泳動，彼此相遇而特異性結合，在比例合適處形成可見的沉淀物。該技術提高了沉淀反應的速度和敏感度，廣泛用于臨床實驗診斷和科學研究。凝膠免疫電泳技術四無沉淀線出現表明無相應的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度＞抗原，反之，則是抗體濃度＜抗原濃度。一、對流免疫電泳技術單向免疫擴散和電泳的定量檢測技術。固定抗體不移動，抗原向正極泳動，隨著抗原量減少，基底區(qū)越來越窄，形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個如火箭的沉淀峰，峰的高度與抗原量呈正相關?；鸺庖唠娪緢D①②③④為標準抗原；⑤⑥為標本-+二、火箭免疫電泳技術三、免疫電泳技術SPGAMκ

λSPGAMκ

λSPGAMκ

λ四、免疫固定電泳技術沉淀反應的臨床應用五沉淀試驗的臨床應用1.經典的沉淀反應均可用于抗原抗體性質、效價、純度及相對分子質量和濃度的分析。2.免疫濁度法目前主要用于蛋白質的測定，如血液中的免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ輕鏈、λ輕鏈，補體C3、C4，血漿蛋白，C-反應蛋白，類風濕因子等；尿及腦脊液微量蛋白和半抗原（激素、毒物、治療性藥物等）；還可用于血漿藥物濃度的測定。

3.對流免疫電泳與火箭免疫電泳因存在電滲作用，目前已不推薦使用。4.免疫電泳擴散時間長，影響因素多，結果較難分析。5.免疫固定電泳分辨力強，敏感度高，結果易于分析，現常用于鑒定遷移率相近的蛋白和M蛋白，免疫球蛋白輕鏈，尿液、腦脊液等微量蛋白，游離輕鏈，補體裂解產物等，臨床最常用于M蛋白的鑒定與分型，并已列入臨床實驗室的常規(guī)檢測工作。1.主要用于血液、體液中蛋白質的測定。2.優(yōu)點：穩(wěn)定性好，敏感度高，精確度高，簡便快速，易于自動化，無放射性核素污染，適合大批量標本檢測。

3.對流免疫電泳與火箭免疫電泳技術由于電滲的緣故已不推薦使用。4.免疫電泳擴散時間長，影響因素多，結果不易分析。5.免疫固定電泳分辨力強，敏感度高，結果易于分析，常用于M蛋白的鑒定與分型。沉淀反應在醫(yī)學檢驗中的應用小結沉淀反應是指可溶性抗原與相應抗體在適當條件下發(fā)生特異性結合而出現可見的沉淀現象。根據反應介質和檢測方法的不同，沉淀反應可分為液相內沉淀試驗、凝膠內沉淀試驗和凝膠免疫電泳技術。凝集反應與沉淀反應的比較比較點凝集反應沉淀反應抗原性質顆粒性/可溶性抗原可溶性抗原反應用載體RBC、膠乳、活性炭瓊脂、醋酸纖維膜反應時間幾分鐘到十幾分鐘數小時到數天稀釋對象多稀釋抗體多稀釋抗原陽性結果凝集沉淀線/沉淀峰敏感性高低知識目標1.掌握：沉淀反應的概念及特點；免疫電泳技術的種類和原理（重點）。2.熟悉：凝膠內沉淀試驗的種類及原理，免疫電泳的應用（重難點）。3.了解：液相沉淀試驗的原理；各種沉淀試驗的技術要點和影響因素；沉淀反應的臨床應用。能力目標掌握：凝膠內沉淀試驗和免疫電泳技術的操作方法熟悉：雙擴和免疫電泳技術的結果判讀和臨床應用思政-素質目標愛崗敬業(yè)、責任心、細心、耐心、質控和生物安全意識、免疫學思維教學目標沉淀反應的概念及特點。液相內沉淀試驗的原理及種類。凝膠內沉淀試驗的原理及種類。雙向瓊脂擴散試驗的應用。凝膠免疫電泳技術的種類及原理。沉淀反應方法的技術要點、影響因素及臨床應用。本章要點沉淀反應概述一液相內沉淀反應二凝膠內沉淀反應三凝膠免疫電泳技術四沉淀反應的臨床應用五目錄環(huán)狀沉淀試驗：抗原溶液疊加在細玻璃管內的抗體液面上，二者在兩液面交界處形成白色沉淀環(huán)。絮狀沉淀試驗：可溶性抗原、抗體在液相中特異性結合，形成絮狀沉淀物。免疫比濁度分析：透射、散射和免疫膠乳比濁法，應用于自動化。液相內沉淀反應二第一節(jié)液相內沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗免疫比濁度分析抗原溶液疊加在細玻璃管內的抗體液面上，二者在兩液面交界處形成白色沉淀環(huán)。可溶性抗原、抗體在液相中特異性結合，形成絮狀沉淀物。透射、散射和免疫膠乳比濁法該法受抗原抗體比例影響非常顯著，常用于測定抗原抗體反應最適比例。標本需要量大、靈敏度低、分辨力差、只能定性，臨床幾乎不用。該法最大優(yōu)點穩(wěn)定性好、敏感度高、精確度高、簡便快速、易于自動化。絮狀沉淀試驗是將抗原與相應抗體混合，在電解質存在的條件下，抗原抗體結合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。方法受抗原抗體比例的影響非常明顯應用于測定抗原抗體反應的最適比例三種類型：①抗原稀釋法：抗原最適比例②抗體稀釋法：抗體最適比例③方陣滴定法：抗原抗體最適比例絮狀沉淀試驗1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量相同振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖沉示意圖淀AgAbAg知識目標1.掌握：沉淀反應的概念及特點；免疫電泳技術的種類和原理（重點）。2.熟悉：凝膠內沉淀試驗的種類及原理，免疫電泳的應用（重難點）。3.了解：液相沉淀試驗的原理；各種沉淀試驗的技術要點和影響因素；沉淀反應的臨床應用。能力目標掌握：凝膠內沉淀試驗和免疫電泳技術的操作方法熟悉：雙擴和免疫電泳技術的結果判讀和臨床應用思政-素質目標愛崗敬業(yè)、責任心、細心、耐心、質控和生物安全意識、免疫學思維教學目標沉淀反應的概念及特點。液相內沉淀試驗的原理及種類。凝膠內沉淀試驗的原理及種類。雙向瓊脂擴散試驗的應用。凝膠免疫電泳技術的種類及原理。沉淀反應方法的技術要點、影響因素及臨床應用。本章要點沉淀反應概述一液相內沉淀反應二凝膠內沉淀反應三凝膠免疫電泳技術四沉淀反應的臨床應用五目錄環(huán)狀沉淀試驗：抗原溶液疊加在細玻璃管內的抗體液面上，二者在兩液面交界處形成白色沉淀環(huán)。絮狀沉淀試驗：可溶性抗原、抗體在液相中特異性結合，形成絮狀沉淀物。免疫比濁度分析：透射、散射和免疫膠乳比濁法，應用于自動化。液相內沉淀反應二第一節(jié)液相內沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗免疫比濁度分析抗原溶液疊加在細玻璃管內的抗體液面上，二者在兩液面交界處形成白色沉淀環(huán)?？扇苄钥乖?、抗體在液相中特異性結合，形成絮狀沉淀物。透射、散射和免疫膠乳比濁法該法受抗原抗體比例影響非常顯著，常用于測定抗原抗體反應最適比例。標本需要量大、靈敏度低、分辨力差、只能定性，臨床幾乎不用。該法最大優(yōu)點穩(wěn)定性好、敏感度高、精確度高、簡便快速、易于自動化。絮狀沉淀試驗是將抗原與相應抗體混合，在電解質存在的條件下，抗原抗體結合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。方法受抗原抗體比例的影響非常明顯應用于測定抗原抗體反應的最適比例三種類型：①抗原稀釋法：抗原最適比例②抗體稀釋法：抗體最適比例③方陣滴定法：抗原抗體最適比例絮狀沉淀試驗1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量相同振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖沉示意圖淀AgAbAg知識目標1.掌握：沉淀反應的概念及特點；免疫電泳技術的種類和原理（重點）。2.熟悉：凝膠內沉淀試驗的種類及原理，免疫電泳的應用（重難點）。3.了解：液相沉淀試驗的原理；各種沉淀試驗的技術要點和影響因素；沉淀反應的臨床應用。能力目標掌握：凝膠內沉淀試驗和免疫電泳技術的操作方法熟悉：雙擴和免疫電泳技術的結果判讀和臨床應用思政-素質目標愛崗敬業(yè)、責任心、細心、耐心、質控和生物安全意識、免疫學思維教學目標沉淀反應的概念及特點。液相內沉淀試驗的原理及種類。凝膠內沉淀試驗的原理及種類。雙向瓊脂擴散試驗的應用。凝膠免疫電泳技術的種類及原理。沉淀反應方法的技術要點、影響因素及臨床應用。本章要點沉淀反應概述一液相內沉淀反應二凝膠內沉淀反應三凝膠免疫電泳技術四沉淀反應的臨床應用五目錄指可溶性抗原、抗體在含有電解質的凝膠內自由擴散形成濃度梯度，二者在比例合適的位置形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)。根據抗原與抗體反應的方式和特性，可分為單向瓊脂擴散試驗和雙向瓊脂擴散試驗。凝膠內沉淀反應三根據試驗形式可分為試管法和平板法兩種，試管法因沉淀環(huán)不易觀察及定量，目前較少應用。

抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關。本法穩(wěn)定、簡便、無需儀器設備。重復性和線性均可信，但靈敏度稍差、耗時長、影響因素多。一、單向瓊脂擴散試驗（平板法）沉淀環(huán)抗原抗體+瓊脂傾注平板

打孔

加樣

放置37℃，24～48h觀察沉淀環(huán)2.單向瓊脂擴散試驗（平板法）單向瓊脂擴散試驗結果：上排為5個不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清3.方法評價：穩(wěn)定、簡便、無需儀器設備。重復性和線性均可信，但靈敏度稍差、耗時長、影響因素多。4.臨床應用：用于檢測血清中Ig含量；單個補體成分含量

影響因素：－抗體質量－標準曲線，質控血清－結果與真實含量不符－雙環(huán)現象（不同擴散率抗原性相同的兩個組分）

上排為5個不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清將抗原抗體分別加在瓊脂糖凝膠不同的對應孔中，兩者在凝膠中自由擴散，在比例合適處形成白色沉淀線。沉淀線的位置、形狀以及對比關系，可進行定性分析，如抗原或抗體的存在與否、相對含量估計、相對分子量分析和性質分析。本法操作簡單、特異性高、結果可靠、成本低廉，但靈敏度低，耗時長，不能精確定量。二、雙向瓊脂擴散試驗（平板法）1.抗原或抗體的定性分析。2.抗原、抗體的相對分子量和相對濃度的估計。

雙向瓊脂擴散試驗應用A：Ag、Ab濃度及分子量近似；B：Ag、Ab濃度近似，分子量Ag＜Ab；C：Ag、Ab濃度近似，分子量Ag＞Ab；D：濃度Ag＞Ab，分子量近似；E：濃度Ag＞Ab，分子量Ag＜Ab；F：濃度Ag＜Ab，分子量Ag＞Ab抗原完全相同抗原部分相同抗原完全不同3.抗原性質的分析4.抗體效價的測定5.抗原或抗體純度的鑒定知識目標1.掌握：沉淀反應的概念及特點；免疫電泳技術的種類和原理（重點）。2.熟悉：凝膠內沉淀試驗的種類及原理，免疫電泳的應用（重難點）。3.了解：液相沉淀試驗的原理；各種沉淀試驗的技術要點和影響因素；沉淀反應的臨床應用。能力目標掌握：凝膠內沉淀試驗和免疫電泳技術的操作方法熟悉：雙擴和免疫電泳技術的結果判讀和臨床應用思政-素質目標愛崗敬業(yè)、責任心、細心、耐心、質控和生物安全意識、免疫學思維教學目標沉淀反應的概念及特點。液相內沉淀試驗的原理及種類。凝膠內沉淀試驗的原理及種類。雙向瓊脂擴散試驗的應用。凝膠免疫電泳技術的種類及原理。沉淀反應方法的技術要點、影響因素及臨床應用。本章要點沉淀反應概述一液相內沉淀反應二凝膠內沉淀反應三凝膠免疫電泳技術四沉淀反應的臨床應用五目錄電泳分析與沉淀反應的結合產物，即可溶性抗原和抗體在直流電場的作用下，在凝膠內加速定向泳動，彼此相遇而特異性結合，在比例合適處形成可見的沉淀物。該技術提高了沉淀反應的速度和敏感度，廣泛用于臨床實驗診斷和科學研究。凝膠免疫電泳技術四無沉淀線出現表明無相應的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度＞抗原，反之，則是抗體濃度＜抗原濃度。一、對流免疫電泳技術單向免疫擴散和電泳的定量檢測技術。固定抗體不移動，抗原向正極泳動，隨著抗原量減少，基底區(qū)越來越窄，形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個如火箭的沉淀峰，峰的高度與抗原量呈正相關?；鸺庖唠娪緢D①②③④為標準抗原；⑤⑥為標本-+二、火箭免疫電泳技術技術要點：

1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內加待測樣品，樣品孔放負極側，6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標準曲線，求出待測樣品濃度。影響因素：

瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)則;

電泳終點時間的確定;

標本數量多時應先通電后加樣,防止寬底峰形;

IgG定量時，可用甲醛與IgG上的氨基結合（甲酰化），抵消了電滲作用。三、免疫電泳技術技術要點：制備瓊脂板，打孔，加樣于孔內，電泳2～3mA/cm，0.5～1h后，槽內加入相應抗血清作雙向擴散。影響因素抗原抗體比例不當,需測抗原抗體最適比;抗血清的抗體譜，混合抗血清的使用;電泳條件直接影響分辨率。應用

純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常免疫球蛋的識別與鑒定SPGAMκ

λSPGAMκ

λSPGAMκ

λ四、免疫固定電泳技術分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需數小時，結果易于分析。應用最常用于M蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質的檢測與κ、λ分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測與分型。優(yōu)點免疫固定電泳知識目標1.掌握：沉淀反應的概念及特點；免疫電泳技術的種類和原理（重點）。2.熟悉：凝膠內沉淀試驗的種類及原理，免疫電泳的應用（重難點）。3.了解：液相沉淀試驗的原理；各種沉淀試驗的技術要點和影響因素；沉淀反應的臨床應用。能力目標掌握：凝膠內沉淀試驗和免疫電泳技術的操作方法熟悉：雙擴和免疫電泳技術的結果判讀和臨床應用思政-素質目標愛崗敬業(yè)、責任心、細心、耐心、質控和生物安全意識、免疫學思維教學目標沉淀反應的概念及特點。液相內沉淀試驗的原理及種類。凝膠內沉淀試驗的原理及種類。雙向瓊脂擴散試驗的應用。凝膠免疫電泳技術的種類及原理。沉淀反應方法的技術要點、影響因素及臨床應用。本章要點沉淀反應概述一