4.3.1 色譜分析概述

2016-044.3

色譜分析法ANALYSISBY

CHROMATOGRAPHY本節(jié)內(nèi)容概要色譜分析概述氣相色譜分析液相色譜分析其他色譜分析方法玻璃柱：色譜柱碳酸鈣顆粒：固定相石油醚：流動相

4.3.1色譜分析概述

GENERALINTRODUCTIONTOCHROMATOGRAPHY1903年由俄國植物學(xué)家茨維特M.S.Tswett分離植物色素時采用。1903年3月21日為色譜日“Heinventedtheseparationofmoleculeswhichkeepshumansintouch”對色譜方法兩相更進(jìn)一步的認(rèn)識：流動相：色譜工作時，流過色譜柱的物質(zhì)。它既可以是氣體，也可以是液體，還可以是超臨界體。既可以是單質(zhì)或單一化合物，也可以是一定比例的混合物。固定相：色譜工作時，固定相在色譜柱中固定不動。通常其核心是一類惰性物質(zhì)，如硅膠、硅藻土等。對于氣固、液固色譜法來說，固定相既是惰性物質(zhì)；對于氣液、液液色譜法固定相=惰性物質(zhì)（載體）+固定液（粘稠的液體或固體有機(jī)物）。在載體和固定液之間有物理的涂裹，現(xiàn)多為化學(xué)鍵合。固定液是固定相的一部分，在毛細(xì)管色譜柱中只有固定液而沒有載體。

色譜法在國民經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究中的作用上世紀(jì)30~40年代為揭開生物世界的奧秘，分離復(fù)雜的生物組成發(fā)揮了獨特的作用。上世紀(jì)50年代為石油工業(yè)的研究和發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)。上世紀(jì)60~70年代為石化、化學(xué)工業(yè)等部門的分析檢測工具。目前是食品科學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等眾多研究領(lǐng)域的重要手段和方法。色譜法在分析化學(xué)中的地位和作用：高超的分離能力，無可替代，無法比擬。

色譜法分類按流動相物理狀態(tài)分：

氣體為流動相的色譜稱為氣相色譜（GC）根據(jù)固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體），又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC，簡稱GC）。

液體為流動相的色譜稱液相色譜（LC）液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC,簡稱LC）．超臨界流體為流動相的色譜稱為超臨界流體色譜（SFC）。隨著色譜工作的發(fā)展，通過化學(xué)反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜（CBPC）。

按分離機(jī)理：利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為離子交換色譜法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為空間排阻色譜法。

著名品牌的現(xiàn)代分析儀器設(shè)備生產(chǎn)公司安捷倫主要生產(chǎn)：GC、GC-MS、GC-MS/MS；HPLC、

UHPLC、LC-MS、LCMS/MS；NMR賽默飛世爾科技主要生產(chǎn)：GC、GC-MS、GC-MS/MS；HPLC、UHPLC、LC-MS/MS、OrbitrapLC/MS；IC布魯克主要生產(chǎn)：GC、GC-MS、GC-MS/MS；

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LC-MS、LCMS/MS；IR、AAS

與分析儀器相關(guān)的信息、譜庫資源網(wǎng)站http:///http:////chemistry/cas-ser.html譜圖由TXT文件中數(shù)字模擬生成舉例和說明：六六六CAS登錄號：608-73-1第1段數(shù)碼為2-7位，升序排列，數(shù)碼越大化合物越新，注冊登錄越晚。第2段為2位數(shù)碼。第3段位校驗碼，1位數(shù)碼，用于判斷此登錄號是否正確。校驗碼計算規(guī)則：第2段數(shù)碼最后1位數(shù)乘1，第2位乘2；依次第1段數(shù)碼最后1位乘3，……，乘積相加，和除10，余數(shù)為校驗碼。六六六CAS登錄號校驗碼計算(3×1+7×2+8×3+0×4+6×5)=71÷10=余數(shù)1http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi有NMR譜圖,及少量的RAMAN,ESR譜圖顯示的譜圖為PNG或JPG格式圖片34/scdb/農(nóng)藥有事問名網(wǎng)(農(nóng)藥名網(wǎng))

色譜流出曲線及主要術(shù)語

流出曲線和色譜峰

填充柱色譜分離示意圖

如果進(jìn)樣量很小，濃度很低，色譜峰如果對稱，可用Gauss正態(tài)分布函數(shù)表示：

式中：C—不同時間t時某物質(zhì)的濃度，C0—進(jìn)樣濃度，tr—保留時間，σ—標(biāo)準(zhǔn)偏差?；€

是柱中僅有流動相通過時，檢測器響應(yīng)訊號的記錄值，即圖中O-t線．穩(wěn)定的基線通過電子線路的衰減表面上看似“一條水平直線”

。從色譜流出曲線上，可以得到的重要信息：

◎

根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個數(shù)。

◎根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進(jìn)行定性分析。

◎根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析。

◎色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù)。

◎色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和流動相)選擇是否合適的依據(jù)。

色譜分析的基本原理色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。但是兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的動力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動力學(xué)兩方面來研究色譜行為。

兩個組分完全分離的條件兩組分的分配系數(shù)必須有差異區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)小于區(qū)域分離的速率在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱。分配系數(shù)K和分配比k分配系數(shù)K

分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復(fù)多次地分配過程。這種分離過程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)。它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達(dá)平衡時的濃度之比值，即分配比k

分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比。即組分保留值與分配比的關(guān)系？如何測量？

分離度

相鄰兩組色譜峰保留值之差與兩個色譜峰峰底寬度總和之半的比值。

R=0.6R=0.8R=1.0R=1.25R應(yīng)達(dá)到1~2，兩個組分最好基線分離（1）高柱效，高分離度（2）高柱效，低分離度（3）低柱效，低分離度（4）低柱效，高分離度

塔板理論

最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。塔板理論為半經(jīng)驗理論。式中：n–理論塔板數(shù)L–色譜柱長H–每塊塔板的高度

塔板理論用熱力學(xué)觀點形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的分配平衡和分離過程，導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型，并成功地解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計算和評價柱效的參數(shù)。但由于它的某些基本假設(shè)并不完全符合柱內(nèi)實際發(fā)生的分離過程，例如，縱向擴(kuò)散不能解釋造成譜帶擴(kuò)張的原因和影響板高的各種因素，也不能說明為什么在不同流速下可以測得不同的理論塔板數(shù)，這就限制了它的應(yīng)用。

速率理論

1956年荷蘭學(xué)者vanDeemter等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學(xué)理論—速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，從而在動力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。VanDeemter方程的數(shù)學(xué)簡化式為式中：u為流動相的線速度；A，B，C為常數(shù)，分別代表渦流擴(kuò)散項系數(shù)、分子擴(kuò)散項系數(shù)、傳質(zhì)阻力項系數(shù)?，F(xiàn)分別敘述各項系數(shù)的物理意義。渦流擴(kuò)散項A在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進(jìn)中形成紊亂的類似“渦流”的流動，故稱渦流擴(kuò)散，形象地如圖所示。A＝2λdp上式表明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速變和組分性質(zhì)無關(guān)。為了減少渦流擴(kuò)散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于中空的石英毛細(xì)管色譜柱，不存在渦流擴(kuò)散。因此A≈0。峰右側(cè)為時間記錄起點0分子擴(kuò)散項B/u（縱向擴(kuò)散項）

縱向分子擴(kuò)散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。如圖18S2所示。它隨著流動相向前推進(jìn)，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)地向前和向后擴(kuò)散，造成譜帶展寬。B＝2γDg式中γ是填充柱內(nèi)流動相擴(kuò)散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴(kuò)散的阻礙情況。Dg為組分在流動相中擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）。傳質(zhì)阻力項Cu由于氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，它們的傳質(zhì)過程不完全相同。（l）對于氣液色譜，傳質(zhì)阻力系數(shù)C包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg和液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl兩項，即

C＝Cg＋Cl

氣相傳質(zhì)過程是指試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程。這一過程中試樣組分將在兩相間進(jìn)行質(zhì)量交換，即進(jìn)行濃度分配。有的分子還來不及進(jìn)入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進(jìn)入兩相界面又來不及返回氣相。這樣，使得試樣在兩相界面上不能瞬間達(dá)到分配平衡，引起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。對于填充柱，氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cg為式中k為容量因子。由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度規(guī)則的平方成正比、與組分在載氣流中的擴(kuò)散系數(shù)見成反比。因此，采用粒度小的填充物和相對分子質(zhì)量小的氣體（如H2）做載氣，可使Cg減小，提高柱效。液相傳質(zhì)阻力系數(shù)C1為由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴(kuò)散系數(shù)Dl大，則液相傳質(zhì)阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值隨之變小，又會使Cl增大。當(dāng)固定液含量一定時，液膜厚度隨載體的比表面積增加而降低，因此，采用比表面積較大的載體來降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附會造成拖尾峰，也不利分離。雖然提高柱溫可增大Dl，但會使k值減小，為了保持適當(dāng)?shù)腃l值，應(yīng)控制適宜的柱溫。將上式總結(jié)，即可得氣液色譜速率板高方程

這一方程對選擇色譜分離條件具有實際指導(dǎo)意義，它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動相的種類及流速，固定相的液膜厚度等對柱效的影響。

填充柱的氣液色譜的速率方程：毛細(xì)管柱的氣液色譜的速率方程：

液液分配色譜的速率方程：因素變化柱效率擔(dān)體粒度變大？填充均勻提高（H下降）載氣密度提高提高（H下降）壓力提高提高（H下降）流速提高在某一流速下H極小溫度升高？固定液液量下降提高（H下降）粘度下降提高（H下降）影響柱效率的因素

色譜分析定量常用的方法☆面積歸一化法（適于高純度樣品；同系物等。）☆內(nèi)標(biāo)法（適于常量分析,亦可用于痕量分析）-注意內(nèi)標(biāo)物的選擇☆外標(biāo)法（適于痕量分析及HPLC常量分析）內(nèi)標(biāo)物種類和使用方法主要有兩大類1增塑劑類（常用有鄰苯二甲酸二丙酯、鄰苯二甲酸二丁酯等）2正構(gòu)烷烴類（常用的有C18~C28等）上述兩類內(nèi)標(biāo)物適用于GC-FID;增塑劑類適用于HPLC-UV。使用（見實驗指導(dǎo)書實驗五），具體的配制方法：首先依據(jù)擬選定的內(nèi)標(biāo)物的保留值來確定。接下來要“配重”。配重的含義是分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰高響應(yīng)值相近（進(jìn)樣濃度：GC-FID一般為200mv;HPLC-DAD的吸光度值為0.43左右）。然后，配制內(nèi)標(biāo)溶液（量要足夠多）。用內(nèi)標(biāo)溶液分別稀釋定容（通常100mL容量瓶）稱量的標(biāo)樣（約0.1g）、樣品（折算適量）。結(jié)果計算舉例：1.7.1面積歸一法

有一樣品色譜流出峰3個，峰1的峰面積134524、峰2的峰面積55678、峰3的峰面積3396，求組分2的百分含量（X2）：據(jù)公式解色譜分析標(biāo)準(zhǔn)中通常規(guī)定進(jìn)樣規(guī)則：在選定的色譜條件下，在反復(fù)多次進(jìn)入標(biāo)樣且每針間色譜峰面積在允許差范圍內(nèi)后，正式進(jìn)樣分析。進(jìn)樣順序：標(biāo)、樣、樣、標(biāo)。1.7.2

內(nèi)標(biāo)法測定化合物A的有效成分含量稱取化合物A標(biāo)準(zhǔn)品（含量為99%）0.1012克，在100mL容量瓶中用二甲基甲酰胺溶解，加入內(nèi)標(biāo)物為鄰苯二甲酸二丁酯（500mg/L）5mL，定容至刻度。稱取化合物A樣品0.1120克，在100mL容量瓶中用二甲基甲酰胺溶解，加入內(nèi)標(biāo)物鄰苯二甲酸二丁酯（500mg/L）5mL，定容至刻度。儀器條件：靈敏度：1.5衰減：7紙速：4波長：254nm，進(jìn)樣量皆為10

L測定結(jié)果：化合物A標(biāo)準(zhǔn)品平均峰面積為15780，內(nèi)標(biāo)物平均峰面積為16890；化合物A樣品平均峰面積為13550，內(nèi)標(biāo)物平均峰面積為16870。求化合物A樣品的有效成分百分含量。解：將測得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標(biāo)樣溶液中，化合物A與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比，分別進(jìn)行平均。以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示的化合物A含量X，按下式計算：

式中：

—標(biāo)樣溶液中，化合物A與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；

—試樣溶液中，化合物A與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；

m1—化合物A標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2—試樣的質(zhì)量，g；

P—標(biāo)樣中化合物A的質(zhì)量百分含量。化合物A的百分含量：1.7.3外標(biāo)法測定化合物B的有效成分含量稱取化合物B標(biāo)準(zhǔn)品（含量為99.8%）0.1008克，在100mL容量瓶中用三氯甲烷溶解，定容至刻度。稱取化合物B樣品0.2053克，在100mL容量瓶中用三氯甲烷溶解，搖勻定容至刻度。儀器條件：FID。溫度（℃）：氣化室240柱箱200檢測器

250。進(jìn)樣量皆為1

L。測定結(jié)果：化合物B標(biāo)準(zhǔn)品平均峰面積為33986；化合物B樣品平均峰面積為24399。求化合物B樣品的有效成分百分含量。