DB32T 1824-2011 禽肉肌纖維特性的測定石蠟切片法

ICS65.020.30備案號：DB32禽肉肌纖維特性的測定石蠟切片法Determinationofpoultrymusclefiber——Paraffinsectionmethod江蘇省質量技術監(jiān)督局發(fā)布DB32/T1824—2011本標準按GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構與編寫》的規(guī)定編寫。本標準由江蘇省家禽科學研究所提出。本標準起草單位：江蘇省家禽科學研究所、農業(yè)部家禽品質監(jiān)督檢驗測試中心（揚州）、揚州翔龍禽業(yè)發(fā)展有限公司。本標準主要起草人：唐修君、高玉時、王克華、葛慶聯(lián)、陸俊賢、施祖灝、張小燕、蒲俊華。1DB32/T1824—2011禽肉肌纖維特性的測定石蠟切片法本標準規(guī)定了石蠟切片法測定禽肉肌纖維特性的術語和定義、試劑與配制、儀器和設備、樣品處理、切片制作、讀片與計算、數(shù)據紀錄和允許差。本標準適用于石蠟切片法測定禽類肌纖維密度、直徑、間距、肌束間距以及肌大束間距。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本部分。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本部分。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本標準3.1肌纖維密度Musclefiberdensity同一肌束內，單位面積肌纖維根數(shù)。3.2肌纖維直徑Musclefiberdiameter肌纖維長徑與短徑的幾何平均數(shù)。3.3肌纖維間距Musclefibergap同一肌束內，相鄰肌纖維之間的垂直距離。3.4肌束間距Musclebundlegap同一肌大束內，相鄰肌束之間的垂直距離。3.5肌大束間距Distancebetweenmusclebundles相鄰肌大束之間的垂直距離。4試劑與配制2DB32/T1824—2011除特殊注明外，本法所用試劑均為分析純，用水符合GB/T6682一級水的規(guī)定。4.14%甲醛溶液1體積甲醛與9體積水混勻。4.2無水乙醇4.375%酒精7.5體積無水乙醇與2.5體積水混勻；85%酒精：8.5體積無水乙醇與1.5體積水混勻；95%酒精：9.5體積無水乙醇與0.5體積水混勻。4.4二甲苯4.5石蠟65℃反復提煉，直至蠟的顏色泛黃可用。4.6蘇木素4.71%鹽酸酒精1體積鹽酸與99體積無水乙醇混勻。4.80.5%伊紅酒精稱取0.5g伊紅，用100mL無水乙醇溶解。4.9中性樹脂5儀器和設備5.1組織切片機切片厚度5μm～1000μm。5.2烘箱精度±1℃。5.3恒溫水浴鍋精度±1℃。5.4包埋框5.5鑷子使用之前放入60℃烘箱中預熱。5.6載玻片和蓋玻片用洗液浸泡24h后用自來水充分洗滌，再用95%酒精浸泡后用軟綢布或紗布擦干，待用。5.7光學顯微鏡DB32/T1824—2011放大倍數(shù)10×4至10×40。6樣品處理6.1取樣與固定家禽宰殺放血后，在30min內順著肌纖維方向取樣，胸肌取樣部位為胸大肌前端1/3、距龍骨2cm處，腿肌取樣部位為大腿肌中部，距股骨1cm處，取樣大小為長×寬×高約2cm×1cm×1cm。剔除肌肉表面筋、腱、膜及脂肪，隨即置于4%甲醛溶液中固定10h，取出修成0.7cm×0.6cm×0.4cm大小的組織塊，重新置于4%甲醛溶液中繼續(xù)固定12h。6.2洗滌將組織樣置于流動的自來水下，浸泡10h~15h。6.3脫水采用不同濃度的酒精對組織樣進行梯度脫水，脫水步驟、酒精濃度和各步驟所需時間見表1。表1脫水步驟、酒精濃度和各步驟所需時間一二三四五6.4透明將組織放進二甲苯中浸泡10min～15min，至組織呈半透明或透明狀態(tài)，用肉眼可觀察到透明感時立即取出。6.5浸蠟和換蠟6.5.1浸蠟：將透明好的組織塊完全置于60℃石蠟中浸泡2h。6.5.2換蠟：將蠟塊取出立即另置于60℃新蠟中再浸泡2h左右。6.6包埋和修塊將熔化的石蠟倒入包埋框，待蠟將近凝固之前，用鑷子將組織塊放至包埋框接近底部的位置，使肌纖維長軸與待切面垂直，將準備好的標簽放在待凝固的蠟上面，完全自然冷卻后，切去余蠟部分，根據需要適當修整蠟塊，一般修成方形或梯形。7切片制作7.1切片、展片和貼片、烤片7.1.1切片：使用組織切片機切片，切片厚度宜為7μm，前15張切片一般不用。7.1.2展片和貼片：將切好的蠟片輕輕平鋪于10-20℃水中展片，用載玻片從切片下面輕輕撈起，立4DB32/T1824—2011即置于40℃恒溫水浴鍋中貼片，切片和載玻片之間不應有氣泡。7.1.3烤片：將粘有切片的載玻片置于60℃烘箱內烤片24h。7.2染色切片烤片后采用二甲苯兩次脫蠟、梯度酒精洗二甲苯，之后進行蘇木素-伊紅（HE）染色。各步驟名稱、所需試劑和時間見表2表2切片染色各步驟名稱、所需試劑和時間一二三四五六七八九十十一7.3封片如需長期保存切片，則應進行封片。切片晾干后，使用中性樹脂封片，中性樹脂的量以封片后能完全蓋住切片為宜，封片過程中不應有氣泡。8讀片與計算8.1肌纖維密度隨機取3張切片，每張切片取3個或3個以上視野，在10×10倍顯微鏡下讀出每個視野肌纖維根數(shù)，求加權平均數(shù)，按公式（1）計算。X=（X1/Y1＋X2/Y2＋X3/Y3……＋Xn/Yn）×106/N………………（1）X——肉樣肌纖維密度，單位為根每平方毫米（根/mY——每個視野面積，單位為平方微米（um8.2肌纖維直徑隨機取3張切片，每張切片取3個視野，每個視野取10根或10根以上肌纖維，在10×40倍顯微鏡下，測量每根肌纖維長徑和短徑距離，算出幾何平均值，再求加權平均數(shù)，按公式（2）計算。X=[（X1＋Y1）/2X2＋Y2）/2X3＋Y3）/2……Xn＋Yn）/2]/N…（2）5DB32/T1824—2011X——肉樣肌纖維直徑，單位為微米(μmX——肌纖維長軸距離，單位為微米(μmY——肌纖維短軸距離，單位為微米(μm8.3肌纖維間距隨機取3張切片，每張切片取3個視野，每個視野測量10個或10個以上間距，在10×40倍顯微鏡下，測量每個間距距離，求加權平均數(shù)，按公式（3）計算。X=（X1＋X2＋X3……＋Xn）/N………………（3）X——肉樣肌纖維間距、肌束間距或肌大束間距，單位為微米(μmX