蘋果樹腐爛病抗病性鑒定技術規(guī)范

1蘋果樹腐爛病抗性鑒定技術規(guī)范本文件規(guī)定了蘋果樹腐爛病抗病性鑒定的術語和定義、接種體制備、鑒定條件和設計、鑒定接種、病情調查、抗性結果、鑒定結果、檔案記錄。本文件適用于蘋果生產(chǎn)過程中腐爛病的抗病性鑒定。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1接種體用于接種以引起病害的任何病原物或病原物的一部分。3.2接種懸浮液用于接種的含有定量接種體的液體。3.3接種室指在無菌的環(huán)境下進行病原菌種擴繁、轉接、接種的房間。4接種體制備4.1病原菌分離從病斑邊緣病健交界處剪取0.5cmx0.5cm大小的病組織，用75%乙醇消毒90s，然后用無菌水沖洗3次，用滅菌濾紙將水吸干，置于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4℃下保存?zhèn)溆?。蘋果腐爛病菌的學名、形態(tài)特征和分子生物學特征見附錄A。4.2接種體繁殖將保存的病原菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)10d～15d，待菌落表面形成分生孢子器。其中，PDA培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。4.3接種體懸浮液制備2用滅菌移植針挑取菌落表面形成的分生孢子器并破碎收集分生孢子，將分生孢子并用無菌水稀釋配制成濃度約為1×106個孢子/mL的接種體懸浮液。5鑒定條件和設計5.1接種室接種室為可人工調節(jié)濕度、溫度和光照等條件，具體室溫為25℃、光周期12h光照/12h黑暗、相對濕度35%～40%。5.2鑒定設計鑒定材料隨機排列，每份鑒定材料重復3次，每重不低于10個枝條，以紅富士健康樹枝條接種腐爛病菌為對照。5.3鑒定材料田間采集用于抗性鑒定蘋果品種的健康、長勢一致、無側枝2年生枝條，截取長度為150cm并兩端蠟封。用自來水沖洗2次，75%酒精沖洗1次，無菌水沖洗1次，自然風干備用。6鑒定接種采用燙傷法接種，用直徑5mm的釘帽在在備用鑒定材料上燙傷5個傷口，傷口間距25cm。每個傷口接種10μL接種懸浮液，完成后用保鮮膜包扎燙傷部位，接種4個傷口，1個傷口為對照。將完成接種的枝條扦插在裝有細沙的花盆中，置于鑒定室培養(yǎng)。7病情調查7.1調查時間與方法接種后5d調查發(fā)病情況，用刀片刮除枝條接種點周圍樹皮，測量病斑長度。接種蘋果腐爛病菌的發(fā)病癥狀描述見附錄A。7.2病情級別蘋果離體枝條腐爛病病情級別見表1。表1蘋果離體枝條腐爛病病情級別0135797.3病情指數(shù)計算3病情指數(shù)（DI）按式（1）計算。Σ(各病情級別數(shù)值×各病情級別的病斑數(shù))調查的總病斑數(shù)×病情級別的最高數(shù)值Σ(各病情級別數(shù)值×各病情級別的病斑數(shù))調查的總病斑數(shù)×病情級別的最高數(shù)值8抗性結果依據(jù)病情指數(shù)(DI)的平均值確定不同品種對腐爛病的抗性水平，抗性結果見表2。表2蘋果樹腐爛病抗性結果病情指數(shù)（DI）注：對照感病品種的病情指數(shù)DI＞70作為9鑒定結果鑒定結果原始記錄表見附錄B，鑒定結果報告單按附錄C執(zhí)行。10檔案記錄將鑒定品種、接種方法、接種日期、調查日期、操作員等內容填表記錄，歸檔并保存2年。抗病性鑒定檔案記錄表見附錄D。4蘋果樹腐爛病病原菌A.1學名和形態(tài)描述A.1.1學名蘋果樹腐爛病病原學名為蘋果殼囊孢（CytosporamaliGrove）、屬子囊菌門（Ascomycota）、糞Ehrenb.）。A.1.2形態(tài)描述蘋果殼囊孢（CytosporamaliGrove）在PDA菌落白色至黃褐色、平展、邊緣呈放射狀，中央可產(chǎn)生乳白色分生孢子器。分生孢子器扁瓶形，直徑為480μm～1600μm。分生孢子單孢、香蕉形、兩端圓、微彎曲，大?。?.6μm～6μm）×（0.8μm～1.7μm）。（a）蘋果殼囊孢在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖A.1蘋果殼囊孢的形態(tài)特征A.2分子生物學特征將待提DNA的蘋果殼囊孢接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃下，光暗交替培養(yǎng)5d，后用滅菌牙簽刮取培養(yǎng)基表面菌絲，收集到滅菌的1.5mL離心管中，采用CTAB法提取菌株基因組DNA。以上述基因組DNA為模板，分別以引物對ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b和EF1-728F/EF1-986R（序列見表A1）擴增ITS、β-tubulin和EF1-α基因。ITS引物對ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），β-tubulin引物對Bt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’）和Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’）EF1-α引物對EF1-728F（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’）和EF1-986R（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’）。PCR反應總體系為25μl，各組分如下：10×PCRreactionbuffer2.5μl，10mMdNTP0.5μL，正反引物（濃度為10mM）各0.5μl，1UExTaqDNA聚合酶（TaKaRa，Japan）0.25μL，模板DNA10-20ng，用ddH2O補至25μl。ITS和β-tubulin基因PCR的反應條件一致，為94℃2min預變性；94℃變性60s，退火58℃60s，72℃90s，35個循環(huán)；72℃10min。EF1-α的擴增條件為95℃3min5預變性；95℃變性30s，退火55℃30s，72℃60s，35個循環(huán)；72℃10min。擴增產(chǎn)物用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像儀觀察，切膠回收目的基因擴增產(chǎn)物，片段連入PMD18-T載體，進行序列測定，獲得序列后中進行系統(tǒng)發(fā)育分析。A.3發(fā)病癥狀描述接種蘋果殼囊孢后5d后，接種處呈現(xiàn)褐色壞死病斑、病健交界明顯、斑易剝離、內部紅褐色、酒糟氣味，部分品種在接種處出現(xiàn)分生孢子器和分生孢子角。蘋果品種抗腐爛病鑒定結果記錄蘋果品種抗腐爛病鑒定結果記錄表見表B.1。表B.1蘋果品種抗腐爛病鑒定結果記錄表（DI）013579）：