DB32T 1775-2011 I型鴨肝炎病毒的檢測RT-PCR 方法　

ICS65.020.30備案號：DB32I型鴨肝炎病毒的檢測RT-PCR方法MethodofRT-PCRdetectin江蘇省質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布DB32/T1775—2011為規(guī)范I型鴨肝炎病毒分子生物學檢測技術，提高鴨肝炎病毒檢測的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性，特制定本標準。本標準按GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準結構和編寫》編制。本標準的附錄A為規(guī)范性附錄。本標準由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提出。本標準起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學院。本標準起草人：魏雪濤、李銀、劉宇卓、張敬峰。1DB32/T1775—2011I型鴨肝炎病毒的檢測RT-PCR方法本標準規(guī)范了I型鴨肝炎病毒分子生物學檢測技術RT-PCR的所用引物大小、所涉及的樣品范圍、操作流程、反應條件等技術標準。本標準適用于檢測鴨肝臟和病毒尿囊液中I型鴨肝炎病毒核酸。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T541-2002動物疫病實驗室檢驗采樣3方法原理聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。PCR技術卻以其快速、敏感和特異等優(yōu)點在動物疫病檢測中得到廣泛應用，而且隨著PCR技術的不斷改進，這種針對病原核酸的診斷方法表現(xiàn)出更準確、靈敏和特異的特點。本標準選取了DHVIVP1基因的保守，設計了一對特異性引物，經(jīng)過了PCR條件的優(yōu)化、特異性實驗、敏感性試驗等，對DHVI的鑒定具有很高的準確性。4儀器設備和主要試劑4.1儀器設備：PCR儀，離心機，電泳槽，微量移液器，凝膠成像系統(tǒng)4.2主要試劑：TRIZOL，氯仿，異丙醇，無水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌雙蒸水，AMV反轉錄酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，RNA酶抑制劑，25mmol/LMgCl2，EXTaqDNA聚合酶，10×EXTaqDNA聚合酶buffer，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，瓊脂糖。上游引物：5′-ATCTAATGTCCCGATACAAGGTG-3′；下游引物：5′-ACGCTAGTGTTTTGAGTCTAAGGC-3′。6樣品采集按照NY/T541-2002動物疫病實驗室檢驗采樣方法，病死或撲殺鴨，無菌采集肝臟組織。7方法步驟2DB32/T1775—2011試驗用水：按照GB-T6682-2008三級水標準7.1樣品處理取病料0.5g～1g置研缽中剪碎并研磨，反復凍融研磨，將研磨好的組織，用生理鹽水1︰5稀釋，以4℃12000r/min離心10min，取上清200μL備用。陰性對照：沒有發(fā)病的正常鴨肝臟陽性對照：用中和試驗檢測DHV陽性肝臟樣品（見附錄A）7.2DHVRNA的提取取已處理的待檢樣品，以DHV陽性病毒為陽性對照，以正常肝臟作為陰性對照，無菌水為空白對照，每管依次加入Trizol600μL，振蕩混勻后，室溫放置10min，加入氯仿200μL，劇烈振蕩后，室溫放置1min，4℃12000r/min，離心15min，取上層水相750μL，加入500μL異丙醇，混勻，﹣20℃放置15min，4℃12000r/min,離心15min，去上清，緩緩加入75%乙醇1mL洗滌，4℃8000r/min離心5min，去上清，室溫干燥RNA樣品沉淀20min，加入DEPC水10μL，使充分溶解。7.3RT-PCR反轉錄反應：5×AMVBuffer4μL、10mmol/LdNTPs2μL、下游引物1μL、RNA酶抑制劑0.5μL、RNA模板10μL，AMV反轉錄酶0.5μL，H2O（DEPC處理）2μL，總體積為20μL，瞬間離心混勻，65℃反應15min，42℃孵育1h，95℃5min，同時設立陰性、陽性對照，產(chǎn)物于﹣20℃保存?zhèn)溆谩?PCR的反應：按25μL體系進行，含MgCl2（25mmol/L）1.5μL，滅菌水15μL，反轉錄產(chǎn)物4μL，10×EXTaqDNA聚合酶buffer2.5μL，2mmol/LdNTP0.5μL，上、下游引物50pmol/μL各0.5μL，EXTaqDNA聚合酶0.5μL。94℃3min，然后進入循環(huán)94℃30s，52℃30s，72℃30s，30個循環(huán)，于72℃延伸10min，4℃保存。7.4結果觀察將PCR反應產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120V，時間30min，紫外燈下觀察結果，并進行拍照。8結果判定在陽性對照出現(xiàn)相應擴增帶、陰性對照無此擴增帶是判定結果。檢測樣品出現(xiàn)與陽性對照相同目的條帶大小為365bp的擴增片段是，判定為該樣品為I型鴨肝炎核酸陽性；否則判定維陰性。如果陽性對照無相應的目的條帶，可能是存在操作失誤，該試驗需要做重復試驗；如果陰性對照有相應的目的條帶，可能是陰性對照存在污染或是操作失誤，該試驗需要做重復試驗。3DB32/T1775—2011(規(guī)范性附錄)陽性樣品的制備用中和試驗檢測DHV陽性肝臟樣品，陽性樣品按如下方法制備：首先，無菌采集新鮮DHV陽性鴨肝臟，用無菌的剪刀剪碎并稱量，然后以質(zhì)量比1∶5加入DEPC（diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯）水，研磨成懸液，裝入用DEPC處理過的離心管中，于﹣20℃反復凍融3次，以12000r/min，冷凍離心20min，取上清接種