3普通菜豆抗普通細(xì)菌性疫病田間鑒定技術(shù)規(guī)范

Q/LB.□XXXXX-XXXXDB14/T1367—2024目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14接種體制備 25田間抗性鑒定 26病情調(diào)查 37抗性評價 48接種鑒定后材料處理 49鑒定記載表 4附錄A（資料性）菜豆普通細(xì)菌性疫病病原菌 5附錄B（資料性）牛奶吐溫選擇性培養(yǎng)基 6附錄C（資料性）牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 7附錄D（資料性）普通菜豆抗普通細(xì)菌性疫病鑒定結(jié)果記載表 8前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。——增加了“術(shù)語與定義”中的內(nèi)容（見3.4）；——更改了“病原物的分離、純化及保存”中的內(nèi)容（見4.1）；——更改了“鑒定圃設(shè)計”中的內(nèi)容（見5.2）；——增加了“鑒定材料要求”（見5.3）；——更改了“調(diào)查時間”中的內(nèi)容（見6.1）；——更改了“調(diào)查取樣”中的內(nèi)容（見6.2）；——更改了“抗性鑒定評價標(biāo)準(zhǔn)”標(biāo)題（見7.2）；——更改了“接種鑒定后材料處理”的內(nèi)容（見8.2）；——更改了“鑒定記載表”中的內(nèi)容（見第9章）。本文件由山西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、組織實施和監(jiān)督檢查。山西省市場監(jiān)督管理局對標(biāo)準(zhǔn)的組織實施情況進(jìn)行監(jiān)督檢查。本文件由山西省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SXS/TC19)歸口。本文件起草單位：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件主要起草人：王燕、郝曉鵬、董雪、朱振東、趙建棟、暢建武。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2017年首次發(fā)布為DB14/T1367—2017；——本次為第一次修訂。普通菜豆抗普通細(xì)菌性疫病田間鑒定技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了普通菜豆種質(zhì)抗普通細(xì)菌性疫病田間鑒定的術(shù)語和定義、接種體制備、田間抗性鑒定、病情調(diào)查、抗性評價、接種鑒定后材料處理、鑒定記載表。本文件適用于普通菜豆對普通細(xì)菌性疫病的田間抗性鑒定及評價。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4404.2糧食作物種子第2部分：豆類NY/T2060.1辣椒抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第1部分：辣椒抗疫病鑒定技術(shù)規(guī)程術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。普通菜豆豆科（Leguminosae），蝶形花亞科（Papilionoideae），菜豆族（Phaseoleae），菜豆屬（Phaseolus）中的一個栽培種，一年生草本植物，學(xué)名PhaseolusvulgarisL.。英文名為Commonbean。染色體2n=22。菜豆普通細(xì)菌性疫病由地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種（Xanthomonasaxonopodispv.phaseoli）引起的以葉部形成有亮檸檬黃色邊緣包圍的不規(guī)則病斑，病斑合并導(dǎo)致大面積組織損傷，使葉片壞死、脫落，病株呈灼燒狀為主的菜豆細(xì)菌性病害。該病害在菜豆的整個生育期內(nèi)均可發(fā)生，病菌可侵染葉片、莖蔓、豆莢及種子等產(chǎn)生不同病癥。病原菌的生物學(xué)特性情況見附錄A?？共⌒蕴镩g鑒定將一定濃度病原菌懸浮液直接接種到田間植株的葉片、果實、莖稈及根等部位，依據(jù)植株的發(fā)病情況進(jìn)行抗病性鑒定?？共⌒灾参矬w所具有的能夠減輕或克服病原物致病作用的可遺傳性性狀。普通菜豆對普通細(xì)菌性疫病的抗病性依據(jù)病情指數(shù)劃分為高抗、抗、中抗、感、高感五個抗性水平。接種體制備病原物的分離、純化及保存采集具有典型病斑的普通菜豆葉片或病莢，采用常規(guī)組織分離方法在牛奶吐溫選擇性培養(yǎng)基（成分及制備見附錄B）上分離病原物。分離物經(jīng)菌落形態(tài)鑒定確認(rèn)為地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種后，進(jìn)行分離物純化，經(jīng)致病性測定后，在4℃低溫下保存?zhèn)溆?。接種體選用地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種作為抗病性田間鑒定的接種體。接種體的繁殖和保存繁殖將將純化的菌株于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（成分及制備見附錄C）中，在28℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h，用滅菌蒸餾水稀釋至菌液濃度為1×108cfu/mL，接種懸浮液用于田間接種。保存挑取病原菌的單菌落接種于裝有1mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的菌種保藏管中，在28℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜。離心后，加入50%滅菌甘油，在-80℃低溫下保存?zhèn)溆?。田間抗性鑒定鑒定圃選擇鑒定圃選擇在普通細(xì)菌性疫病常發(fā)區(qū)，該區(qū)排灌方便、土地平整、肥力水平中等以上。鑒定圃設(shè)計適期播種，鑒定材料隨機(jī)或順序排列，3次重復(fù)；每份材料播種3m2，行長3m，行寬0.5m，每行留苗15株，株距約0.2m。鑒定圃周圍設(shè)保護(hù)行或保護(hù)區(qū)。鑒定材料要求鑒定材料的種子質(zhì)量應(yīng)符合GB4404.2—20104.2.3中赤豆的要求，其中品種純度符合大田用種要求。播種使用的種子大小、色澤均勻一致，不作物理或化學(xué)處理。鑒定對照品種每10份～15份鑒定材料設(shè)1組已知抗病、感病對照材料。抗病對照品種為“洋菜豆（F0001292）”，感病對照品種為“黑金豆（F0001585）”。接種時期植株生長到第1片三出復(fù)葉至開花期前期均可接種。接種方法人工接種鑒定采用噴霧接種法。用噴霧器對葉片上、下表面均勻噴霧，接種至整個植株完全濕潤。接種后管理接種后田間應(yīng)充分灌溉，保證病菌的入侵、擴(kuò)展。接種前后避免施用任何藥劑。病情調(diào)查調(diào)查時間病情調(diào)查于接種后20天左右，即感病對照病狀達(dá)到其相應(yīng)感病程度時進(jìn)行。調(diào)查取樣每份鑒定材料棋盤式取樣，田塊均勻劃成4個小區(qū)，每區(qū)隨機(jī)取5株，共調(diào)查20株。調(diào)查部位植株葉片和莢的外部癥狀。病情級別劃分接種植株病情分級及其相對應(yīng)的癥狀描述見表1。病情級別劃分病情級別癥狀描述0沒有可見癥狀。1局部可見輕微水漬狀病斑；莢上沒有病斑。3有少量小病斑，發(fā)病面積約占整葉的2%；一般莢上沒有病斑。5小病斑開始合并，有的被黃色暈圈包圍，輕微枯萎，發(fā)病面積約占整葉的5%；莢上病斑小，不合并。7中等和大病斑被黃色暈圈和壞死組織包圍，發(fā)病面積約占整葉的10%；莢上病斑大，合并，常常有菌膿產(chǎn)生。9大病斑合并壞死，發(fā)病面積約占整葉的25%以上，導(dǎo)致葉片脫落；莢上病斑合并擴(kuò)展，產(chǎn)生大量菌膿，有的導(dǎo)致莢變形或空莢。調(diào)查及計算根根據(jù)病害癥狀描述，調(diào)查每份鑒定材料接種單株的發(fā)病情況，確定病情級別，并計算每份鑒定材料的病情指數(shù)（DI）。按如下公式計算病情指數(shù)： (AUTONUM)式中：DI——病情指數(shù)Ci——病情級別Ni——各病情級別的植株數(shù)N——調(diào)查總植株數(shù)抗性評價鑒定有效性判別當(dāng)感病對照材料達(dá)到其相應(yīng)感病程度（DI＞50），該次材料的抗病性鑒定為有效?？剐澡b定評價依據(jù)病情指數(shù)3次重復(fù)的平均值評價各鑒定材料的抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表2。抗性評價標(biāo)準(zhǔn)病情指數(shù)抗性評價0.00＜DI≤10.00高抗（HR）10.00＜DI≤30.00抗（R）30.00＜DI≤50.00中抗（MR）50.00＜DI≤70.00感?。⊿）DI＞70.00高感（HS）接種鑒定后材料處理將接種后剩余接種體集中滅菌處理。將鑒定后的田間病株集中銷毀。鑒定記載表普通菜豆抗普通細(xì)菌性疫病鑒定結(jié)果記載表參照NY/T2060.1，記載表見附錄D。

（資料性）

菜豆普通細(xì)菌性疫病病原菌學(xué)名地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種（Xanthomonasaxonopodispv.phaseoli）生物學(xué)特性病原菌屬好氣性革蘭氏陰性菌，極生單根鞭毛，桿狀，菌體長0.5μm～3.0μm，寬0.3μm～0.8μm，有莢膜，不產(chǎn)生芽孢。在含碳源的固體培養(yǎng)基上形成圓滑、黃色、黏稠狀菌落。生長最適溫度為30℃，最高為38℃，致死溫度為50℃，10min。酸堿度范圍為pH5.7～8.4，最適為pH7.3。能液化明膠，使石蕊牛乳變藍(lán)并凝固；不能液化果膠凝膠，不產(chǎn)生果膠酶。在含有乙酸的培養(yǎng)基上生長的細(xì)胞具有乙醛酸循環(huán)的酶類，能產(chǎn)生類似細(xì)菌素的物質(zhì)。

（資料性）

牛奶吐溫選擇性培養(yǎng)基成分10g示蛋白胨（Oxoid）、0.25g無水氯化鈣、0.5g酪氨酸、15g瓊脂粉、10g脫脂奶粉、40mg制霉素，80mg頭孢氨芐，10mg鹽酸萬古霉素、10ml吐溫80和1000ml去離子水。制備稱取10g示蛋白胨（Oxoid）、0.25g無水氯化鈣、0.5g酪氨酸和15g瓊脂粉溶解到500ml蒸餾水；稱取10g脫脂奶粉溶解到500ml蒸餾水；取10ml吐溫80裝入獨立三角瓶中；上述三組成分在121℃高壓蒸汽滅菌15min；滅菌后上述三組成分在無菌條件下混合；將40mg制霉素、80mg頭孢氨芐、10mg鹽酸萬古霉素分別溶解于10ml70%酒精；當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，在無菌條件下加入三種抗生素溶液，混合均勻，之后培養(yǎng)基倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，每皿15ml。

（資料性）

牛