DB32T 4395-2022 小麥土傳病毒病病原檢測技術(shù)規(guī)程

小麥土傳病毒病病原檢測技術(shù)規(guī)程江蘇省市場監(jiān)督管理局I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1黃花葉病毒(wheatyellowmosaicvirus)。CWMV:中國小麥花葉病毒(ChineseWheatMosaicVirus)Dot-ELISA:斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附劑測定(DotEnzyme-linkedImmunosorbentAssELISA:酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay)間接ELISA:間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定(IndirectEnzyme-linkedImmunosoPCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReRT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(ReverseTranWYMV:小麥黃花葉病毒(WheatYellowMosaicVirus)可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)。顏色反應(yīng)的深淺與受檢樣品中抗原的量呈正比，24.3RT-PCR原理將逆轉(zhuǎn)錄(RT)和聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。逆轉(zhuǎn)錄是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成與之互補(bǔ)的DNA(complementaryDNA,cDNA)的過程，再利用特異性引物以田間采集疑似小麥黃花葉病和中國小麥花葉病的小麥病株，采用附錄C中的特異性引物進(jìn)行RT-產(chǎn)物長度為182bp的小麥樣品則認(rèn)定為感染CWMY的陽性樣品；則認(rèn)定為陰性樣品，陽性樣品和陰性樣品存放于-80℃低溫冰箱；間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定和斑點(diǎn)酶6間接ELISA待檢測樣品按1:10(克：毫升)加入包被緩沖液，用研缽研磨成漿，8000r/min離心3min,上清3孵育結(jié)束后，用聚對苯二甲酸乙二醇酯(PBST)清洗酶標(biāo)板3次～5次。每孔每次加PBST洗液700μL,每次停留1min～2min。用相應(yīng)病毒抗血清和抗體稀釋緩沖液按照1:2000的比例稀釋，每孔加入稀釋好的抗體液的OD?o?值<0.15,陰性對照孔的OD?o?值<0.15,當(dāng)陰性對照孔的OD?o5值<0.05時(shí)，按0.05計(jì)算。陽性對照有明顯的顏色反應(yīng)，且陽性對照OD?o?值/陰性對照OD?o?值>2,孔的重復(fù)性基本一致。6.12.2在滿足了6.12.1質(zhì)量控制要求后，可根據(jù)如下數(shù)據(jù)判斷結(jié)果：樣品OD?o?值/陰性對照OD?o?值>2,判為陽性；樣品OD?o5值/陰性對照OD?o?<2,判為陰性；樣品OD?o?值陰性對照OD?o?值在47.1取樣待測樣品和對照樣品按1:10(克：毫升)加入硫化鉛(PBS)磷酸鹽緩沖液，用研缽研磨成漿，用相應(yīng)病毒抗血清和抗體稀釋緩沖液按照1:2000的比例稀釋，并將硝酸纖維素膜浸入其中，室溫孵育30min～60min。將平皿中抗體液倒出，加入PBST20mL洗膜3次～4次，每次3min。顯色底物氯化硝基四氮唑蘭(NBT)66μL和BCIP338.1植物總RNA提取MiniKit)的操作步驟提取病葉RNA,然后在紫外分光光度計(jì)上測定所提RNA的濃度和純度。56(規(guī)范性)間接ELISA試劑9.6,用蒸餾水定容至1000mL。A.2PBST緩沖液(pH7.4)氯化鈉(NaCl)8.0g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g,磷酸氫二鈉(Na?HPO?)1.15g,氯化鉀(KCl)0.2g,0.5mLTween-20,溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,蒸餾水定容A.4抗血清堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，抗體效價(jià)：1:2000,-20℃保存。二乙醇胺9.7mL,氯化鎂(MgCl?)0.01g,溶解于80mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至9.8,用蒸餾水定容至100mL。A.7底物溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)7(規(guī)范性)B.1PBS磷酸鹽緩沖液(pH7.2)氯化鈉(NaCl)8.0g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g,磷酸氫二鈉(Na?HPO?)1.15g,氯化鉀(KCl)0.2g,溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)pH至7.2,蒸餾水定容至1000mL。B.2PBST緩沖液(pH7.4)氯化鈉(NaCl)8.0g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g,磷酸氫二鈉(Na?HPO?)1.15g,氯化鉀(KCl)0.2g,0.5mLTween-20,溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,蒸餾水定容至1000mL。B.3封閉液取脫脂奶粉5g加入到100mLPBST,充分溶解，4℃保存。B.4抗血清病毒特異性抗體，抗體效價(jià)：1:2000,-20℃保存。B.5酶標(biāo)抗體堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，抗體效價(jià)：1:2000,—20℃保存。B.6底物稀釋緩沖液(pH9.5)Tris·Cl12.11g,氯化鎂(MgCl?)2.38g,氯化鈉(NaCl)5.85g,溶解于900mL蒸餾水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.5,用蒸餾水定容至1000mL。B.7底物溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)堿性磷酸酶顯