第18章-補(bǔ)體檢測及補(bǔ)體參與的試驗(yàn)

臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第十八章補(bǔ)體檢測及補(bǔ)體參與的試驗(yàn)陳育民目錄補(bǔ)體與補(bǔ)體系統(tǒng)的概念補(bǔ)體的理化特性與生物學(xué)功能血清總補(bǔ)體活性測定單個(gè)補(bǔ)體成分的測定補(bǔ)體參與的試驗(yàn)補(bǔ)體測定的臨床意義補(bǔ)體與補(bǔ)體系統(tǒng)的概念補(bǔ)體（complement）是存在于正常人或脊椎動物新鮮血清中的一種不耐熱的成分，可輔助和補(bǔ)充特異性抗體介導(dǎo)的溶菌、溶血作用。補(bǔ)體系統(tǒng)（complementsystem）因補(bǔ)體并非單一成分，是由30余種可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白組成，故稱為補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體系統(tǒng)根據(jù)各成分的功能不同，可分為補(bǔ)體固有成分、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白和補(bǔ)體受體三類。正常人體內(nèi)補(bǔ)體成分的含量相對穩(wěn)定。第一節(jié)補(bǔ)體的理化特性與生物學(xué)功能重點(diǎn)提示補(bǔ)體成分的理化特性補(bǔ)體系統(tǒng)的激活補(bǔ)體系統(tǒng)的生物學(xué)功能一、補(bǔ)體成分的理化特性補(bǔ)體成分為糖蛋白和球蛋白（大多是β，少數(shù)為α或γ)，分子量在25kD（D因子）～550kD（C4bp）之間。血清補(bǔ)體蛋白總量約為4g/L，約占血清球蛋白的10%、血清總蛋白的5%～6%，其中C3含量最高，可達(dá)1.3g/L。補(bǔ)體成分的性質(zhì)不穩(wěn)定，易受理化因素影響，如56℃30分鐘即被滅活；在室溫下也會很快失活；在0℃～10℃條件下，補(bǔ)體活性只能保持3天～4天，故補(bǔ)體應(yīng)保存在-20℃以下或冷凍干燥保存。紫外線照射、機(jī)械震蕩、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、乙醇或蛋白酶等也可使補(bǔ)體滅活。二、補(bǔ)體系統(tǒng)的激活正常情況下，體內(nèi)絕大多數(shù)補(bǔ)體成分通常以無活性形式存在，只有活化后才能發(fā)揮其生物學(xué)作用。補(bǔ)體系統(tǒng)可經(jīng)三條途徑激活。經(jīng)典激活途徑（經(jīng)典途徑）凝集素激活途徑（MBL途徑）旁路激活途徑（替代途徑）補(bǔ)體系統(tǒng)三條激活途徑示意圖三、補(bǔ)體系統(tǒng)的生物學(xué)功能溶解細(xì)胞、溶解細(xì)菌和病毒的作用。調(diào)理作用，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬。免疫黏附作用，清除循環(huán)免疫復(fù)合物。炎癥介質(zhì)作用，C5a、C3a和C4a等引起炎癥反應(yīng)。參與特異性免疫應(yīng)答。第二節(jié)血清總補(bǔ)體活性測定重點(diǎn)提示CP-CH50脂質(zhì)體均相免疫溶破試驗(yàn)AP-CH50一、CP-CH50CP-CH50是檢測補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的溶血活性，與C1～C9各組分的量及活性均有關(guān)。原理是SRBC與溶血素結(jié)合成復(fù)合物后，可激活血清中的補(bǔ)體導(dǎo)致SRBC腫脹而發(fā)生溶解（即溶血）。常以50%溶血作為判定終點(diǎn)，它比100%溶血更敏感，故該實(shí)驗(yàn)方法稱為50%補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn)（50%complementhemolysis，CH50）。引起50%溶血所需要的最小補(bǔ)體量為一個(gè)CH50單位（U），通過計(jì)算可測定出待測血清中總的補(bǔ)體溶血活性，以CH50（kU/L）表示。CP-CH50當(dāng)SRBC和溶血素量一定時(shí)，溶血程度與補(bǔ)體量及活性呈正相關(guān)，為特殊的S形曲線。在輕微溶血和接近完全溶血時(shí)，對補(bǔ)體含量的變化不敏感；在30%～70%之間幾乎呈直線，補(bǔ)體含量稍有變動就會造成溶血程度的明顯改變。CP-CH50測定方法稀釋緩沖液：pH7.2～7.4的巴比妥緩沖液（BBS）或磷酸緩沖液。2%SRBC懸液溶血素：商品溶血素按說明的效價(jià)稀釋使用。自制溶血素先加熱滅活補(bǔ)體后，按表18-1滴定效價(jià)，測定補(bǔ)體活性時(shí)大多使用2個(gè)單位的溶血素。50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管：取2%SRBC懸液0.5ml加蒸餾水2ml充分混勻，即為全溶血管；向全溶血管加BBS2.5ml。50%溶血總補(bǔ)體活性的測定：按表18-2操作。50%溶血總補(bǔ)體活性的計(jì)算：以最接近50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管的測定管為終點(diǎn)管，按公式（1/終點(diǎn)管稀釋血清的用量×稀釋度）計(jì)算CH50值（kU/L）。CP-CH50CP-CH50CP-CH50的方法評價(jià)方法簡便、快速，但敏感性較低。結(jié)果反映C1～C9等各成分的量和活性的綜合水平。所用稀釋緩沖液、SRBC的數(shù)量和狀態(tài)、待測血清的新鮮程度、反應(yīng)溫度、pH、離子強(qiáng)度以及反應(yīng)容器的潔凈程度等多種因素均可影響血清總補(bǔ)體活性測定的結(jié)果。每次試驗(yàn)都需要使用新鮮的SRBC，為手工操作的半定量試驗(yàn)，結(jié)果難以令人滿意。二、脂質(zhì)體均相免疫溶破試驗(yàn)試劑1：脂質(zhì)體，其內(nèi)部水相中包入水溶性的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH），雙層內(nèi)包裹抗原-二硝基苯酚（DNP）。試劑2：羊抗DNP抗體和酶底物，底物為6·磷酸萄萄糖（G6P）和輔酶1（NAD）。反應(yīng)過程：羊抗DNP抗體與脂質(zhì)體上DNP結(jié)合成抗原-抗體復(fù)合物，待測血清中的補(bǔ)體被激活，攻擊破壞脂質(zhì)體膜，釋放出G-6-PDH與酶底物（G6P和NAD）發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生NADH。340nm處測吸光度（A），A值與待測血清中的補(bǔ)體活性成一定比例關(guān)系。該法不使用SRBC，血清用量少，影響因素少，操作簡便、快速準(zhǔn)確，適用于自動分析儀測定。三、AP-CH50為測定血清補(bǔ)體旁路激活途徑溶血功能的試驗(yàn)。其原理是家兔紅細(xì)胞未經(jīng)致敏可直接激活人血清中的B因子，引起旁路途徑活化，導(dǎo)致兔紅細(xì)胞溶解。溶血程度與血清中參與旁路激活途徑的補(bǔ)體量及活性呈正相關(guān)。與CP-CH50測定相似，可計(jì)算出待檢血清中補(bǔ)體旁路激活途徑的溶血活性，以AP-CH50kU/L表示。測定時(shí)緩沖液中加入乙二醇雙氨基四乙酸（EGTA)可與待測血清中的Ca2+螯合，阻斷補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑。兔紅細(xì)胞用枸櫞酸鹽抗凝，洗滌后配成0.5%兔紅細(xì)胞懸液備用。其結(jié)果反映C3、B因子、P因子、D因子及C5～C9各組分量及活性。第三節(jié)單個(gè)補(bǔ)體成分的測定重點(diǎn)提示W(wǎng)HO和國際免疫學(xué)會報(bào)告：30多種補(bǔ)體成分主要檢測C3、C4、C1q、B因子和C1INH等5種成分。免疫溶血法（測其活性）免疫化學(xué)法（測其含量）一、免疫溶血法SRBC與溶血素（指示系統(tǒng)）結(jié)合后可激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，導(dǎo)致SRBC溶解，發(fā)生溶血現(xiàn)象。參與反應(yīng)的補(bǔ)體有兩組，一組是缺乏某一補(bǔ)體成分的動物血清或人血清；另一組是待測血清中的補(bǔ)體。測定時(shí)將指示系統(tǒng)與缺乏某一補(bǔ)體成分的血清作用不發(fā)生溶血，此時(shí)加入待測血清，原來缺乏的補(bǔ)體成分得到補(bǔ)償，補(bǔ)體激活的級聯(lián)反應(yīng)完成，即可發(fā)生溶血。溶血程度與待測血清中的某一單個(gè)補(bǔ)體成分的含量與活性相關(guān)該法無需特殊儀器與設(shè)備，試驗(yàn)快速簡便，但敏感性較低，影響因素較多，僅能測定某一補(bǔ)體成分的活性，而不能測定其含量。二、免疫化學(xué)法可測定補(bǔ)體系統(tǒng)單個(gè)成分的含量。檢測方法：單向免疫擴(kuò)散、火箭免疫電泳、免疫比濁法包括透射比濁法和散射比濁法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。前兩種方法已趨于淘汰。免疫比濁法方法簡單，重復(fù)性和特異性好，并能進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化流程管理，進(jìn)行質(zhì)量控制，是目前常用的檢測方法。ELISA具有操作簡單、敏感性高、特異性強(qiáng)、可以自動化等優(yōu)點(diǎn)，不僅對補(bǔ)體系統(tǒng)單個(gè)成分可進(jìn)行定性檢測，也可定量檢測。目前對補(bǔ)體C1～C9的11種蛋白成分、B因子、D因子、P因子、MBL、FCN、MASP、C1INH、H因子、I因子、C4結(jié)合蛋白（C4bp）以及補(bǔ)體的裂解產(chǎn)物C4a、C4b、C2a、C2b、C3a、C3b、iC3b、C3c、C3d、C5a、C5b等均已有商品化的ELISA檢測試劑盒。第四節(jié)補(bǔ)體參與的試驗(yàn)重點(diǎn)提示補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)補(bǔ)體參與的其它試驗(yàn)一、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)反應(yīng)系統(tǒng)：已知的抗原（或抗體）與待測的抗體（或抗原）。補(bǔ)體系統(tǒng)：常用豚鼠新鮮血清。指示系統(tǒng)：SRBC和溶血素，常將二者預(yù)先結(jié)合成致敏SRBC。二、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)試驗(yàn)分兩步，先將反應(yīng)系統(tǒng)與補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)一定時(shí)間后再加入指示系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)是否發(fā)生溶血來判斷試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果不發(fā)生溶血反應(yīng)為陽性，發(fā)生溶血反應(yīng)為陰性。比凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、可檢測的抗原或抗體范圍廣、無需特殊設(shè)備、結(jié)果容易觀察。參與成分多，結(jié)果易受許多因素影響，各種參與成分需要繁瑣的稀釋和滴定，難于標(biāo)準(zhǔn)化。已基本被淘汰。其試驗(yàn)原理和設(shè)計(jì)思路對新型免疫學(xué)檢測方法的建立具有啟迪和指導(dǎo)作用。補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒（CDC）試驗(yàn)正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等帶有特異性抗原的靶細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補(bǔ)體的參與下，可導(dǎo)致靶細(xì)胞膜損傷、通透性增加、細(xì)胞死亡，而不帶特異抗原的細(xì)胞仍存活。伊紅-Y或臺盼藍(lán)等染料可通過損傷的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，使損傷死亡或?yàn)l死細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不著色?？捎糜跈z測細(xì)胞膜抗原（如HLA分型、T細(xì)胞表面抗原等），也可用于鑒定抗體的特異性。三、補(bǔ)體參與的其它試驗(yàn)免疫粘連血凝試驗(yàn)：可檢測多種病毒及其抗體。溶血空斑試驗(yàn)：可檢測抗體形成細(xì)胞（AFC）。膠固素結(jié)合試驗(yàn)：可檢測循環(huán)免疫復(fù)合物。C1q抗體測定試驗(yàn)：常用ELISA法檢測，多種自身免疫性疾病患者的血清中可檢測到C1q抗體，其含量與疾病病情呈正相關(guān)。第五節(jié)補(bǔ)體測定的臨床意義重點(diǎn)提示補(bǔ)體活性與含量增高補(bǔ)體活性與含量降低或缺陷補(bǔ)體裂解產(chǎn)物檢測的臨床應(yīng)用一、補(bǔ)體活性與含量增高各種傳染病組織損傷急性炎癥某些腫瘤患者心肌梗死糖尿病妊娠病情危重時(shí)，總補(bǔ)體活性常呈下降趨勢二、補(bǔ)體活性與含量降低或缺陷1.先天性某些補(bǔ)體成分缺陷C1INH缺陷：可致遺傳性血管神經(jīng)性水腫。C2、C3缺陷：可導(dǎo)致嚴(yán)重的感染。衰變加速因子（DAF）和膜反應(yīng)性溶破抑制物（MIRL）缺陷：可導(dǎo)致陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿。補(bǔ)體受體1（CR1）缺陷：可導(dǎo)致循環(huán)IC的清除障礙。I因子、H因子缺陷：可引起腎小球腎炎。C1q缺陷：可引起嚴(yán)重頑固性皮膚損害。C1q、C1r、C4、C2缺陷：可致免疫復(fù)合物性血管炎（包括腎炎）。2.后天性獲得性補(bǔ)體活性與含量降低補(bǔ)體消耗增多：系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、Ⅱ與Ⅲ型超敏反應(yīng)、自身免疫性溶血性貧血、冷球蛋白血癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、移植排斥反應(yīng)等疾病時(shí)，補(bǔ)體消耗增加，導(dǎo)致血清補(bǔ)體活性與含量降低。其降低程度與疾病的活動、進(jìn)程和療效等有關(guān)。補(bǔ)體大量丟失：如大面積燒傷、大出血和腎病綜合征等，可使大量體液和蛋白質(zhì)丟失，導(dǎo)致補(bǔ)體活性與含量降低。補(bǔ)體合成不足：肝細(xì)胞受損或大量破壞、機(jī)體營養(yǎng)不良等可使補(bǔ)體的合成減少，導(dǎo)致血清補(bǔ)體活性與含量降低。肝病時(shí)血清補(bǔ)體活性與含量降低的順序依次為慢性肝炎、肝細(xì)胞癌、肝硬化和重癥肝炎。三、補(bǔ)體裂解產(chǎn)物檢測的臨床應(yīng)用Ⅲ型超敏反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制與補(bǔ)體活化后產(chǎn)生的C3a、C5a等裂解產(chǎn)物（稱為過敏毒素）有關(guān)。Ⅲ型超敏反應(yīng)性疾病可測定補(bǔ)體裂解產(chǎn)物C3a、C5a等，來了解疾病的進(jìn)展程度。本章小結(jié)補(bǔ)體有30余種成分，存在于正