第四章 抗體制藥第二節(jié) 單克隆抗體及其制備課件

第二節(jié)單克隆抗體及其制備抗體治療疾病的機制

中和作用導(dǎo)向作用拮抗作用

ADCCCDCAgonist第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第二節(jié)單克隆抗體及其制備抗體治療疾病的機制第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第二節(jié)單克隆抗體及其制備抗體的治療應(yīng)用

抗腫瘤抗感染抗器官移植排斥反應(yīng)治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第二節(jié)單克隆抗體及其制備抗體藥物迅速發(fā)展的主要障礙1.免疫原性降低單克隆抗體的免疫原性人體免疫系統(tǒng)對鼠源蛋白的排斥反應(yīng)抗體人源化是解決問題的唯一途徑2.分子量大降低單克隆抗體分子量，增加組織通透性第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第二節(jié)單克隆抗體及其制備單抗研發(fā)的演變歷程第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第二節(jié)單克隆抗體及其制備雜交瘤制備人單抗的問題：染色體易丟失、抗體分泌不穩(wěn)定第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第二節(jié)單克隆抗體及其制備單克隆抗體人源化的改進鼠抗體人源化（人-鼠嵌合、改型抗體）小分子抗體單價（Fab、單鏈、單域、超變區(qū)多肽）多價（Diabody，Triabody，Minibody）特殊類型抗體（雙特異性抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、抗原化抗體、免疫脂質(zhì)體）抗體融合蛋白（免疫粘連素、免疫毒素、催化抗體）人源抗體（噬菌體抗體庫、轉(zhuǎn)基因小鼠）人-人抗體第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備一、人-鼠嵌合抗體二、改形抗體三、Fab和Fv抗體四、單鏈抗體五、單域抗體和分子識別單位第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備

二硫鍵連接的4條多肽鏈重鏈（H），輕鏈(L)

可變區(qū)(V區(qū))，恒定區(qū)（C區(qū)）互補決定區(qū)（CDR）

C區(qū)決定了Ig分子的一種抗原性（免疫原性）

CDR區(qū)決定抗體活性第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備一、第一代的抗體人源化------嵌合抗體

將鼠單克隆抗體（MAb）的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對獨立，其獨特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時仍有較強的HAMA反應(yīng)。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備二、第二代的抗體人源化------改型抗體

在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進一步將鼠單克隆抗體（MAb）可變區(qū)中相對保守的FR（frameworkregion）替換成人的FR，保留與抗原結(jié)合的CDR（complementarydeterminantregion）部位（即CDR移植）第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備小分子抗體

上述的人源化抗體屬完全的抗體分子。通過基因重組技術(shù)，可以在保持原有抗原結(jié)合活性的基礎(chǔ)上，把完整的抗體分子改造成較小的分子，稱為小分子抗體。根據(jù)其價數(shù)的不同分為單價小分子抗體及多價小分子抗體兩種。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備三、Fab抗體和Fv抗體

Fab抗體：Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體相對分子量只有完整lgG的1/3。

Fv抗體：由VH和VL組成的具有完整抗原結(jié)合位點的最小抗體片段，表現(xiàn)出與完整抗體相似的結(jié)合活性，它的發(fā)現(xiàn)推動了抗體的體外重組技術(shù)的發(fā)展。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備四、單鏈抗體

單鏈抗體（singlechainFv，scFv）是由VH和VL

通過連接肽（接頭）重組并表達(dá)而成的另外一種小分子抗體，是具有親代抗體全部抗原結(jié)合特意性的最小功能結(jié)構(gòu)單位。在此基礎(chǔ)上，可與其他效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異性抗體等的理想而基本的元件。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備四、單鏈抗體

優(yōu)點：分子小，僅為完整單體免疫蛋白分子的1/6，容易進入組織，因而可用于腫瘤的診斷和治療；因其為單鏈，易于進行分子改造，如與毒素等拼接成為免疫毒素，可以直接殺傷靶細(xì)胞；3.體內(nèi)半衰期短，免疫原性低。

第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備四、單鏈抗體

缺點：穩(wěn)定性仍較低，這主要是由于scFv分子內(nèi)VH和VL間相互作用較弱，不足以完全抵消分子間的作用力，因而易凝集形成scFv二聚體和多聚體；功能單一，僅能與一種抗原特異性結(jié)合；親和力低，穩(wěn)定性較差，體內(nèi)清除過快。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備五、單域抗體

抗體與抗原的結(jié)合主要是由lg的V區(qū)決定，因此只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或VL

一個功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個lg分子的1/12，故稱之為小抗體。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第三節(jié)基因工程抗體及其制備識別單位

抗體抗原的結(jié)合是經(jīng)過互補決定區(qū)（complement-arydeterminingregin，CDR）而實現(xiàn)的。因此，CDR是構(gòu)成抗原抗體的最小結(jié)構(gòu)單位，根據(jù)這一特點，可以設(shè)計出那些在抗原識別及親和力方面有重要意義的CDR多肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的結(jié)果。這種只含有一個CDR多肽的抗體，稱為超變區(qū)多肽（hypervariablereginpolypeptides，HRP），亦稱為最小識別單位（minimalrecognitionunit，MRU）。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四節(jié)多功能抗體及其制備一、雙功能抗體二、多功能抗體三、抗體融合蛋白第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備一、雙功能抗體

雙功能抗體就是雙特異性單鏈抗體（bispecificsingle-chainFvs，bisFvs）。Holliger于1993年將抗A抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因（VLA）與抗B抗原抗體的重鏈可變區(qū)（VHB）通過短肽連接子連接構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)后形成雙特異性抗體，絕大多數(shù)是在大腸桿菌中以分泌形式表達(dá)的。

將兩條不同來源的scFv組合成具有兩種不同抗原結(jié)合特征的新型抗體即為雙特異單鏈抗體。

第四節(jié)多功能抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備二、多功能抗體

近年來，在scFv的基礎(chǔ)上，可以把兩個或兩個以上的scFv重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。其中包括雙鏈抗體（dia-body），三鏈抗體（tribody），微型抗體（minibody）及四鏈抗體（tetrabody）等。

第四節(jié)多功能抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備雙鏈抗體（diabody）

制備方法第四節(jié)多功能抗體及其制備化學(xué)交聯(lián)法粘性蛋白結(jié)構(gòu)域融合法接頭長度控制法第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備微型抗體（minibody）第四節(jié)多功能抗體及其制備

通過基因工程的手段采用不同的接頭把單鏈抗體（VL-VH）的VH結(jié)構(gòu)域與IgG的CH3結(jié)構(gòu)域融合，形成VL-CH3的結(jié)構(gòu)，稱之為微型抗體（minibody）。此種抗體合成后通過CH3結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定的二聚體形式，發(fā)揮其雙價微抗的作用。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備三鏈抗體（triabody）第四節(jié)多功能抗體及其制備

在制備單鏈抗體時，當(dāng)接頭的長度為2個或2個的以下氨基酸殘基時，或者直接把VH結(jié)構(gòu)域的N末端與VL結(jié)構(gòu)域的C末端相連，通過非共價鍵而形成的三聚體，稱為三鏈抗體，接頭長度在3~12個氨基酸殘基時，則形成雙鏈抗體。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備表達(dá)的抗體分子片段第四節(jié)多功能抗體及其制備第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備雙特異性抗體（BfAb）第四節(jié)多功能抗體及其制備

天然lg是由兩個完全相同的VL和VH區(qū)域構(gòu)成，該區(qū)域是特異性識別并結(jié)合抗原的關(guān)鍵部位。而經(jīng)人工設(shè)計構(gòu)建的雙特異性抗體（BsAb）則由兩個不同的抗原結(jié)合位點組成，可同時與兩種不同的抗原決定簇結(jié)合，并可將其偶聯(lián)的藥物、酶或放射性核素等導(dǎo)向到靶部位，這種具有雙價雙特異性的抗體又稱為雙功能抗體（bifunctionalantibody，RfAb）。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備三、抗體融合蛋白第四節(jié)多功能抗體及其制備抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，稱之為抗體融合蛋白。構(gòu)建抗體融合蛋白的基本原則：將第一個蛋白的終止密碼子刪除，在接上帶有終止密碼子的第二個蛋白基因，即可實現(xiàn)兩個基因共表達(dá)。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備三、抗體融合蛋白第四節(jié)多功能抗體及其制備

酶-抗體型偶合蛋白在藥物治療中應(yīng)用前景廣闊，它可在靶向位置上將前提藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物，從而避免了對正常組織的損害，這種方法成抗體介導(dǎo)的酶前體藥物治療。（前體藥物是指該藥物需在體內(nèi)經(jīng)特定酶催化后才顯示活性的物質(zhì)）?？贵w和酶的融合蛋白定位在腫瘤部位后再給予前提藥物，其優(yōu)點是提高了腫瘤區(qū)域的藥物濃度，降低了對正常細(xì)胞的毒性。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四節(jié)多功能抗體及其制備根據(jù)構(gòu)建方式的不同，抗體融合蛋白主要分為兩種形式:Fc融合蛋白（FcFusionprotein，F(xiàn)cFP）由抗體的Fc段與某些具有特定功能的蛋白結(jié)構(gòu)融合而成。如CD4免疫粘附素（immunoadhesin）就是由抗體的Fc段與2個CD4分子的lg同源區(qū)重組而成?？乖Y(jié)合融合蛋白（antigen-Bindingfusionprotein，ABFP）由具有抗原結(jié)合功能的抗體結(jié)構(gòu)與其他功能蛋白融合而成。如免疫毒素，抗體部分主要包括嵌合抗體、單鏈抗體形式。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四節(jié)多功能抗體及其制備特殊類型抗體

一、細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞內(nèi)抗體柱要是指在細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體，亦稱內(nèi)抗體（intrabody）。目前細(xì)胞內(nèi)抗體的研究主要集中在單鏈抗體上，在scFv的C端或N端插入其他靶向信號（targetingsignals），如分泌、核定位信號、線粒體定位信號和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號等，從而進行檢測、識別、發(fā)揮特定功能。第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四節(jié)多功能抗體及其制備細(xì)胞內(nèi)抗體的應(yīng)用：

由于細(xì)胞內(nèi)抗體具有高度親和力及選擇結(jié)合特性，因而可通過多種機制調(diào)控細(xì)胞的生理過程及代謝。主要為：

分子功能的研究下調(diào)生長因子受體的表達(dá)抑制細(xì)胞內(nèi)癌蛋白的活性抑制病毒復(fù)制第四章抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四節(jié)多功能抗體及其制備細(xì)胞內(nèi)抗體廣泛應(yīng)用前存在的問題：基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立，特別是體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移時基因的靶向傳遞的問題，使細(xì)胞內(nèi)抗體基因?qū)氤渥銛?shù)量的靶細(xì)