牛羊精液牛羊豬種布魯氏菌三重 RT-PCR 檢測方法與分離培養(yǎng)方法征求意見稿

1牛羊精液牛羊豬種布魯氏菌三重RT-PCR檢測方法與分離培養(yǎng)方法本文件規(guī)定了牛羊精液中牛種、羊種和豬種布魯氏菌三重RT-PCR檢測方法和分離培養(yǎng)方法所包括GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范4縮略語BHQ：無熒光淬滅基團(tuán)（Blackholequencher）Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）FAM：6-羧基熒光素（6-caHEX：六氯-6-甲基熒光素（HexachlorofluoresceiPBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebufferedsaline）25.1.40.01mol/LPBS溶液（pH7.4）：按照A.2配制。5.1.7陽性對照：重組質(zhì)粒，制備過程見附錄三重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增用上、下游引物和探針序列見附6.5冰箱，儲藏溫度在2℃~8℃和-20℃以下。樣品的采集、保存與運(yùn)輸按照NY/T5413上，按順序加樣。8.4熒光RT-PCR反應(yīng)R9結(jié)果判定9.1結(jié)果分析條件設(shè)定9.2試驗(yàn)成立的條件9.2.39.2.1和9.2.2要求需在同一次試驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次試驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。9.3結(jié)果描述及判定若被檢樣品在相應(yīng)通道Ct值＜38且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為此通道核酸陽性。Cy5通道陽性熒光信號表示內(nèi)標(biāo)陽性；ROX通道陽性熒光信號表示牛種核酸陽性；FAM種核酸陽性；HEX通道陽性熒光信號表示豬種核酸陽性。只有一種陽性熒光信號為單4若被檢樣品在相應(yīng)通道無Ct值或Ct值＞40，且無特異性擴(kuò)增曲線，判為相應(yīng)病原核9.3.3可疑重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Ct值≤40且有明顯擴(kuò)增曲線則判為相應(yīng)病原核酸陽性，否則判為相應(yīng)病原核培養(yǎng)基、雙相培養(yǎng)基（青島海博生物、青島中創(chuàng)生物公司）、布魯氏菌可疑鮮精液/冷凍參照血培養(yǎng)法觀察結(jié)果，15天仍無可疑菌生只含雙相培基燒瓶中，輕輕混合傾斜，使被檢精液分布在瓊脂斜面上，置37℃溫箱培養(yǎng)，如果懷疑精液是牛種布魯氏菌感染時(shí)，應(yīng)有一半標(biāo)本置CO(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)環(huán)境中培養(yǎng)，為了提高對布魯氏菌的檢出率和從污染的材料中分離布魯氏菌，將被檢材料(固體標(biāo)本加滅菌的生5溶液配置A.1DEPC水蒸水中，攪拌至完全溶解后，調(diào)pH至7.4，加水定容至1L6利用超微量分光光度計(jì)測定陽性重組質(zhì)粒濃度，并按下面公式將濃度換算成拷貝數(shù)，DNA拷貝7Brucellaabortus-RROX-TGCCATCCGTGCTGCCATCG-Brucellamelitensis-FBrucellamelitensis-RBrucellamelitensis-PFAM-AGACAGTGCTTCGTCACGCTAGAGCGBrucellasuis-RHEX-CGGCTTAGACCCTACTTATGCGGTG-CY5-TAACCTCGGCACCAGAAGAACAC8熒光RT-PCR反應(yīng)液配方體積(μL）5×OnestepU+MixBrucellamelitensis-F(10μmol/L)Brucellamelitensis-R(