實(shí)驗(yàn)四血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆针娪痉ǚ蛛x血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義12/8/20241當(dāng)前1頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】12/8/20242當(dāng)前2頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI12/8/20243當(dāng)前3頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。電泳速度:帶電粒子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)時(shí)，單位電場(chǎng)強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，以u(píng)表示，即

V—粒子運(yùn)動(dòng)的速度X—電場(chǎng)強(qiáng)度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度12/8/20244當(dāng)前4頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；12/8/20245當(dāng)前5頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。2.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強(qiáng)度(I)：I越大，電動(dòng)電勢(shì)越小，u越?。籌越小，電動(dòng)電勢(shì)越大，u越大，但樣品易擴(kuò)散。離子強(qiáng)度如果過(guò)低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定選擇離子強(qiáng)度時(shí)要兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.02～0.2之間。12/8/20246當(dāng)前6頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。電場(chǎng)強(qiáng)度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱(chēng)電勢(shì)梯度。3.電場(chǎng)強(qiáng)度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。電場(chǎng)強(qiáng)度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。在進(jìn)行高壓電泳的時(shí)候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無(wú)法分離12/8/20247當(dāng)前7頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。4.支持介質(zhì)：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)12/8/20248當(dāng)前8頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。負(fù)極正極－－－－－－－－表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動(dòng)

如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動(dòng)的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動(dòng)的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場(chǎng)作用下液體對(duì)固體支持物相對(duì)移動(dòng)的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:12/8/20249當(dāng)前9頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。區(qū)帶電泳的分類(lèi)（一）支持物物理性狀1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。12/8/202410當(dāng)前10頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。（二）支持物裝置形式：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤(pán)狀電泳12/8/202411當(dāng)前11頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。(三)pH連續(xù)性：1．連續(xù)pH電泳：即整個(gè)電泳過(guò)程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續(xù)pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電脈，等電聚焦電泳等12/8/202412當(dāng)前12頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。醋酸纖維薄膜為支持物pH=8.6的巴比妥緩沖液血清蛋白的pI均小于8.6負(fù)電荷電泳時(shí)向正極移動(dòng)由于遷移率不同而被分離12/8/202413當(dāng)前13頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。當(dāng)前25頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度為0.當(dāng)前9頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條帶含義②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)可將各色帶剪開(kāi)，分別溶于堿性溶液中。取出薄膜，無(wú)光澤面向上平放在濾紙上臨床上還可用A/G比來(lái)表示清球蛋白的量的關(guān)系：當(dāng)前31頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。當(dāng)前32頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。1．連續(xù)pH電泳：即整個(gè)電泳過(guò)程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。蓋電泳槽蓋，平衡10min點(diǎn)樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點(diǎn)樣面朝下)當(dāng)前23頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。選擇離子強(qiáng)度時(shí)要兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.γβα2α1清蛋白分子越小，泳動(dòng)速度越快帶電量越多，泳動(dòng)速度越快12/8/202414當(dāng)前14頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。膜條經(jīng)過(guò)氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定性,定量各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_(kāi)，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計(jì)算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。12/8/202415當(dāng)前15頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。醋酸纖維薄膜：醋酸纖維加工的細(xì)密且薄的微孔膜廣泛應(yīng)用醫(yī)學(xué)臨床各種生物分子的分離分析血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、類(lèi)固醇及同工酶等12/8/202416當(dāng)前16頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速缺點(diǎn)分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE）不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）12/8/202417當(dāng)前17頁(yè)，共38頁(yè)，星期日?！酒鞑募霸噭?、器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀竹鑷點(diǎn)樣器人血清或雞血清粗濾紙2、試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液12/8/202418當(dāng)前18頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。5mA/片，電泳60~90min繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條帶含義當(dāng)前18頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面選擇離子強(qiáng)度時(shí)要兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期早期：選擇性蛋白尿，Mw較小蛋白質(zhì)丟失，含量下降。甲胎蛋白、類(lèi)固醇及同工酶等實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)當(dāng)前23頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。蓋電泳槽蓋，平衡10min取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min帶電量越多，泳動(dòng)速度越快[操作]（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備1、醋酸纖維素薄膜的潤(rùn)濕與選擇2.電泳槽的準(zhǔn)備3、電極槽的平衡12/8/202419當(dāng)前19頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。（二）點(diǎn)樣取出薄膜，無(wú)光澤面向上平放在濾紙上點(diǎn)樣區(qū)距陰極端1.5cm血清均勻涂在點(diǎn)樣器表面將點(diǎn)樣器輕輕印在點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線

實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)12/8/202420當(dāng)前20頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。（三）電泳點(diǎn)樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點(diǎn)樣面朝下)

另一端平貼在陽(yáng)極端支架

要求：薄膜緊貼濾紙橋并繃直，薄膜之間相隔幾毫米蓋電泳槽蓋，平衡10min打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度為0.3mA/片，通電10min調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度為0.5mA/片，電泳60~90min

電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為O，關(guān)閉電泳儀切斷電源12/8/202421當(dāng)前21頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽12/8/202422當(dāng)前22頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。12/8/202423當(dāng)前23頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。離子強(qiáng)度如果過(guò)低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5minγβα2α1血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白當(dāng)前3頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。分子越小，泳動(dòng)速度越快取出薄膜，無(wú)光澤面向上平放在濾紙上3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤(pán)狀電泳調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條帶含義選擇離子強(qiáng)度時(shí)要兩者兼顧，一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.3mA/片，通電10min12/8/202424當(dāng)前24頁(yè)，共38頁(yè)，星期日?！緦?shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】不要用手觸摸纖維素膜注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面點(diǎn)樣位置要在1.5厘米以內(nèi)，不要距邊緣太近不要重復(fù)點(diǎn)樣膜放進(jìn)電泳槽時(shí)，將點(diǎn)樣面向下，點(diǎn)樣端靠近陰極12/8/202425當(dāng)前25頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣時(shí)不要點(diǎn)的太多，但也不能太少線條均勻，用力水平。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液12/8/202426當(dāng)前26頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。（四）染色和漂洗取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min自來(lái)水沖洗，漂洗液漂洗更換3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜12/8/202427當(dāng)前27頁(yè)，共38頁(yè)，星期日?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】繪出電泳圖譜并標(biāo)明各條帶含義12/8/202428當(dāng)前28頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。12/8/202429當(dāng)前29頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。臨床意義血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％γ球蛋白12％—20％12/8/202430當(dāng)前30頁(yè)，共38頁(yè)，星期日?？赡芟嚓P(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低

球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來(lái)表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人A/G＝1.5～2.512/8/202431當(dāng)前31頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。血漿蛋白的主要功能維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等免疫作用12/8/202432當(dāng)前32頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。白蛋白降低：

合成能力不足：肝功能下降

合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期

去路增加：腎病綜合癥，嚴(yán)重?zé)齻?，大出血?/p>

消耗過(guò)多：糖尿病，甲亢等12/8/202433當(dāng)前33頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。球蛋白增加：感染，多發(fā)性骨髓瘤，自身免疫性疾病等球蛋白降低：皮質(zhì)功能亢進(jìn)，免疫缺陷病12/8/202434當(dāng)前34頁(yè)，共38頁(yè)，星期日。肝?。篈,α2-G,β-G,α1-G,γ-G，A/G下降甚至倒置腎病：早期：選擇性蛋白尿，Mw較小蛋白質(zhì)丟失，含量下降。如白蛋白后期：非選擇性蛋白尿，Mw較小的蛋白質(zhì)丟失，含量下降分子量較大的蛋白質(zhì)（如γ-球蛋白）丟失，含量下降12/8/202435當(dāng)前35頁(yè)，共38頁(yè)，星期日?！緦?shí)驗(yàn)思考】1．電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的正極還是負(fù)極？為什么？2．電泳后，泳動(dòng)在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成分？請(qǐng)分析原因12/8/202436當(dāng)前36頁(yè)，共38頁(yè)，星期日?！境Ｒ?jiàn)問(wèn)題及原因】1.電泳圖譜不齊