第6章-植物基因工程

第六章植物(zhíwù)基因工程共六十九頁第一節(jié)植物基因工程(jīyīngōngchéng)的發(fā)展現(xiàn)狀第六章植物(zhíwù)基因工程共六十九頁植物(zhíwù)基因工程植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作即以分子生物學為理論基礎，采用基因克隆、遺傳(yíchuán)轉(zhuǎn)化（根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導法、基因槍法、原生質(zhì)體介導法等），以及細胞、組織培養(yǎng)技術將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以正確表達和穩(wěn)定遺傳，從而使受體獲得新性狀的技術體系。共六十九頁轉(zhuǎn)基因植物的理論(lǐlùn)前景和意義通過將目的基因?qū)朕r(nóng)作物、園藝作物中，改變它們的遺傳特性，使植物免受病蟲的危害，或獲得抗除草劑的特性，或改變種子中淀粉、蛋白質(zhì)的含量和組成、或改變花的形狀和顏色(yánsè)，或改變植物的育性和不親合性以及改變植物的抗逆性等共六十九頁高等植物基因工程(jīyīngōngchéng)的發(fā)展歷程1983年美國(měiɡuó)和比利時科學家首次將外源基因?qū)霟煵莺秃}卜1994年世界上第一種耐儲藏的番茄在美國批準上市1995年轉(zhuǎn)基因的抗蟲、抗除草劑的玉米和棉花在美國投入生產(chǎn)2000年美國轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積首次超過普通大豆迄今為止世界上共批準了12種作物、6大類性狀的48個轉(zhuǎn)基因品種進行商業(yè)化生產(chǎn)，其中包括水稻、玉米、馬鈴薯、小麥、黑麥、紅薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亞麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡蘿卜、黃瓜、蘆筍、苜蓿、草莓、木瓜、獼猴桃、越橘、茄子、梨、蘋果、葡萄等。共六十九頁抗蟲轉(zhuǎn)基因植物(zhíwù)共六十九頁抗病轉(zhuǎn)基因植物(zhíwù)共六十九頁抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物(zhíwù)共六十九頁轉(zhuǎn)魚抗寒蛋白基因(jīyīn)的番茄共六十九頁轉(zhuǎn)黃瓜(huángguɑ)抗青枯病基因的甜椒共六十九頁利用轉(zhuǎn)基因改良植物(zhíwù)的品質(zhì)共六十九頁提高(tígāo)觀賞價值共六十九頁英國研究人員最近稱，新開發(fā)的紫色轉(zhuǎn)基因番茄(fānqié)中含有在深色漿果中常見的營養(yǎng)成分，并證明可以防止老鼠體內(nèi)的癌細胞蔓延。此項研究的重點是花青素，這種抗氧化劑存在于黑莓和黑醋栗等漿果中，被認為具有降低癌癥、心臟病和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病風險的作用。共六十九頁這種藍玫瑰是轉(zhuǎn)基因玫瑰，被植入三色紫羅蘭所含一種能刺激藍色素產(chǎn)生的基因，花瓣因而自然呈現(xiàn)藍色。藍玫瑰由日本三得利公司(ɡōnɡsī)澳大利亞分支機構研究培育。完成藍玫瑰在自然環(huán)境中的生長實驗和研究后，三得利公司(ɡōnɡsī)計劃明年秋季把藍玫瑰推向市場，預計市場規(guī)?？蛇_數(shù)百億日元。

共六十九頁向小麥插入一種來自煙曲霉（Aspergillusfumigatus）的肌醇六磷酸酶基因(jīyīn)，這種小麥的肌醇六磷酸酶最高可以在89攝氏度的時候保持穩(wěn)定。這種名為肌醇六磷酸酶（phytase，亦稱植酸酶）的酶可以幫助人體吸收鋅和鐵元素。共六十九頁將細菌基因(jīyīn)dhlA和dhlB插入轉(zhuǎn)基因(jīyīn)煙草的基因(jīyīn)組中，清除受污染土壤和地下水的鹵化有機污染物。共六十九頁轉(zhuǎn)基因植物可作為一種生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白和植物次生代謝產(chǎn)物(chǎnwù)，或生產(chǎn)某些有機化合物。轉(zhuǎn)基因植物為人們研究某一基因功能及其再生長發(fā)育中的作用提供了強有力的工具。共六十九頁第二節(jié)植物基因工程(jīyīngōngchéng)方法第六章植物(zhíwù)基因工程共六十九頁一原生質(zhì)體介導法概念：以原生質(zhì)體為受體，借助于特定的化學或物理手段將外源ＤＮＡ直接導入植物細胞的方法。主要(zhǔyào)方法:1)PEG介導的基因轉(zhuǎn)化2)脂質(zhì)體（liposome)介導的基因轉(zhuǎn)化3)電激法4)激光導入法5)顯微注射法共六十九頁1PEG介導的基因(jīyīn)轉(zhuǎn)化原理：利用化學試劑，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(細胞促融劑)等，誘導原生質(zhì)體攝取外源DNA分子，進入原生質(zhì)體的外源DNA分子就有可能通過某種機制(jīzhì)整合到基因組中，完成遺傳轉(zhuǎn)化過程。案例：轉(zhuǎn)基因煙草共六十九頁2脂質(zhì)體介導基因(jīyīn)轉(zhuǎn)化原理：利用(lìyòng)脂類化學物質(zhì)包裹外源DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入受體細胞。特點：轉(zhuǎn)化率高操作繁瑣技術性高共六十九頁3電激法介導基因(jīyīn)轉(zhuǎn)化原理：利用高壓電脈沖作用，在原生質(zhì)體膜上“電激穿孔“，形成可逆的瞬間通道,從而促進外源DNA進入原生質(zhì)體。特點：轉(zhuǎn)化率高；操作簡便；容易造成(zàochénɡ)原生質(zhì)體損傷。共六十九頁４顯微(xiǎnwēi)注射介導的基因轉(zhuǎn)化原理(yuánlǐ)：利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細胞質(zhì)或細胞核，從而實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點：方法簡單、轉(zhuǎn)化率高；純物理方法，適用于各種植物和材料，無局限性；對受體細胞無毒害，有利于轉(zhuǎn)化細胞生長發(fā)育；培養(yǎng)過程無需特殊選擇系統(tǒng)。共六十九頁５激光(jīguāng)微束介導的基因轉(zhuǎn)化原理：將激光引入光學顯微鏡聚焦成微米級的微束照射培養(yǎng)細胞，在細胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入細胞培養(yǎng)基里的外源DNA流入細胞，實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。優(yōu)點(yōudiǎn)：操作簡便；工作效率高；無宿主限制，適應于各種動植物；對受體細胞生命活動影響小；受體的類型廣泛；用于細胞器的基因轉(zhuǎn)化共六十九頁二基因(jīyīn)槍法（微彈轟擊法）工作原理：將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下將微粒高速射入受體細胞或組織，微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上并得到表達(biǎodá)，從而實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。動力類型：火藥爆炸力；高壓氣體；高壓放電共六十九頁操作步驟（1）制備DNA微彈；（2）準備靶外植體材料(cáiliào)；（3）DNA微彈轟擊；（4）培養(yǎng)轟擊后的外植體．共六十九頁轉(zhuǎn)化率影響(yǐngxiǎng)因素 金屬微粒金粉顆粒較鎢粒性質(zhì)優(yōu)良,但是價格昂貴.DNA沉淀輔助劑這些(zhèxiē)化合物對DNA在微粒上的黏附有重要作用,但對植物受體細胞也產(chǎn)生一定的傷害.DNA純度及濃度微彈速度植物材料內(nèi)在因素共六十九頁三、根癌桿菌(gǎnjūn)介導法根癌農(nóng)桿菌廣泛親染雙子葉植物和裸子植物。根據(jù)根癌農(nóng)桿菌誘導植物形成的根瘤中冠癭堿的不同可將根癌農(nóng)桿菌分為章魚(zhānɡyú)堿型、胭脂堿型和農(nóng)桿堿型3種類型在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)有一個大的致瘤質(zhì)粒，簡稱Ti質(zhì)粒。共六十九頁Ti質(zhì)粒的結構(jiégòu)與功能Ti質(zhì)粒的圖譜(túpǔ)整個質(zhì)粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的編碼產(chǎn)物負責：合成吲哚乙酸t(yī)mr的編碼產(chǎn)物負責：合成植物分裂素tmt的編碼產(chǎn)物負責：合成氨基酸衍生物冠癭堿共六十九頁Ti質(zhì)粒的結構(jiégòu)與功能Ti質(zhì)粒致瘤的分子(fēnzǐ)機制損傷的植物根部會分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸，它們能誘導Ti質(zhì)粒上的vir基因以及根瘤菌染色體上的一個操縱子表達。vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達產(chǎn)物則與單鏈T-DNA結合形成復合物，后者轉(zhuǎn)化植物根部細胞。共六十九頁Ti質(zhì)粒的結構(jiégòu)與功能T-DNA的染色體整合(zhěnɡhé)機制共六十九頁T-DNA的染色體整合(zhěnɡhé)機制Ti質(zhì)粒的結構(jiégòu)與功能共六十九頁Ti質(zhì)粒是植物(zhíwù)基因工程的一種天然載體，但野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物(zhíwù)基因工程載體存在著學多障礙：（1）質(zhì)粒過大，造作困難（2）大型的Ti質(zhì)粒有多個酶切位點（3）植物激素類的影響（4）Ti質(zhì)粒中存在不起作用的序列（5）Ti質(zhì)粒的局限性1Ti質(zhì)粒的改造(gǎizào)策略共六十九頁Ti質(zhì)粒的改造(gǎizào)除去T-DNA上的生長素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因為大量的生長素和分裂素會抑止(yìzhǐ)細胞再生長為整株植物；除去T-DNA上的有機堿生物合成基因（tmt）；因為有機堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影響植物細胞的生長；安裝大腸桿菌復制子，使其能在大腸桿菌中復制，以利于克隆操作；安裝植物細胞的篩選標記，如neor基因，使用植物基因的啟動子和polyA信號序列；安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。除去Ti質(zhì)粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體的長度；共六十九頁共整合(zhěnɡhé)轉(zhuǎn)化程序共六十九頁二元整合(zhěnɡhé)轉(zhuǎn)化程序?qū)⑼庠椿蚩寺≡诖竽c桿菌(gǎnjūn)-農(nóng)桿菌(gǎnjūn)穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)；重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株，該菌株攜帶只含vir區(qū)不含T-DNA區(qū)的Ti輔助質(zhì)粒；以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細胞。共六十九頁2根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導的基因轉(zhuǎn)化的分子(fēnzǐ)機理6個步驟：1）農(nóng)桿菌對受體的影響（2）農(nóng)桿菌附著到植物受體細胞（3）誘導啟動毒性區(qū)基因表達（4）類似接合孔復合體的合成和裝配（5）T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運（6）T-DNA的整合共六十九頁3.T-DNA轉(zhuǎn)移的影響因素（1）農(nóng)桿菌菌株（2）農(nóng)桿菌菌株高侵染活力的生長時期（3）基因活化的誘導物（4）外植體的類型(lèixíng)和生理狀態(tài)（5）外植體的預培養(yǎng)（6）外植體的接種及共培養(yǎng)共六十九頁基因槍法與根癌農(nóng)桿菌(gǎnjūn)介導發(fā)的比較(1)基因槍法——多拷貝整合概率高，外源基因默表達農(nóng)桿菌介導——低拷貝整合（多為單拷貝整合）轉(zhuǎn)化效率較高。(2)基因槍法——純物理轉(zhuǎn)化，不存在物種的限制(xiànzhì)。農(nóng)桿菌介導——存在宿主范圍的局限性。(3)基因槍法適于以細胞器為轉(zhuǎn)化目標的轉(zhuǎn)基因研究。共六十九頁第三節(jié)轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)子細胞的篩選第六章植物(zhíwù)基因工程共六十九頁當采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外植體后，通常外植體中僅僅只有幾個少數(shù)細胞獲得轉(zhuǎn)化只有采取有效的轉(zhuǎn)化方法，才能提高準確地選擇到轉(zhuǎn)化細胞。一般(yībān)情況下，轉(zhuǎn)化載體上除了帶有目的基因外，大多還攜帶選擇基因，以供轉(zhuǎn)化細胞篩選使用。共六十九頁轉(zhuǎn)化篩選細胞的方法主要有兩種一是根據(jù)選擇基因的特點在篩選選擇培養(yǎng)基中加入(jiārù)能抑制非轉(zhuǎn)化細胞生長的有毒物質(zhì)如抗生素、除草劑等），選擇基因通常為一種解毒基因，可以解除培養(yǎng)基中有害物質(zhì)對細胞生長的抑制作用，這樣只有轉(zhuǎn)化細胞才能生長繁殖；另一種方式是，受體細胞為營養(yǎng)缺陷型細胞，在選擇性培養(yǎng)基中不能生殖，而選擇基因可以補償這種缺陷，使轉(zhuǎn)化細胞在選擇性培養(yǎng)基上正常生長。共六十九頁一、植物基因工程(jīyīngōngchéng)中的選擇基因植物基因工程中的基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因最常用的有新霉素抗性基因（neor）慶大霉素抗性基因（gentr）潮霉素磷酸(línsuān)轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）以及膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）等共六十九頁1、新霉素抗性基因(jīyīn)（neor）新霉素抗性基因是從大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離的其對應失活的選擇試劑為卡那霉素、新霉素和G418卡那霉素、新霉素可通過與核糖體小亞基結合抑制蛋白質(zhì)的合成，G418可通過抑制80S核糖體的功能而阻斷(zǔduàn)真核細胞中的蛋白質(zhì)合成新霉素抗性基因可使選擇試劑磷酸化而失效。共六十九頁2.慶大霉素抗性基因(jīyīn)（gentr）該基因編碼(biānmǎ)一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，屬抗生素標記基因它通過對慶大霉素的乙?；蛊涫Щ?。該選擇系統(tǒng)目前也有一定的應用，例如矮牛、煙草和番茄。共六十九頁3.潮霉素磷酸(línsuān)轉(zhuǎn)移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一種很強的細胞抑制劑，對許多植物(zhíwù)都有很強的毒性。潮霉素林酸轉(zhuǎn)移酶可通過對潮霉素磷酸化而使其失活。共六十九頁4.膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(jīyīn)（bar）膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，從而導致非轉(zhuǎn)化(zhuǎnhuà)細胞發(fā)生氨的致死性累積。膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）是從吸水鏈霉菌中克隆的一種基因共六十九頁二、報告基因報告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷外源基因是夠成功(chénggōng)地導入體細胞，是否啟動表達的一類特殊用途的基因。它應該不依賴于外界選擇壓力的存在，這一點也是它與選擇基因的區(qū)別之處。共六十九頁理想(lǐxiǎng)報告基因的基本要求：1、受體細胞不粗在相應的內(nèi)源等位基因的活性。2、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會損害受體細胞。3、具有快速、廉價、靈敏、定量和可重復性的檢測特性。共六十九頁目前最常用(chánɡyònɡ)的報告基因有：?-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因3.熒光素酶基因共六十九頁?-葡萄糖苷酸酶基因(jīyīn)（gus）gus基因編碼?-葡萄糖苷酸酶存在于某些細菌體內(nèi)，該酶是一種水解酶，能催化許多?-葡萄糖苷酸類物質(zhì)的水解絕大多數(shù)的植物細胞內(nèi)不存在內(nèi)源的GUS活性，許多細菌及真菌也缺乏內(nèi)源GUS活性因而gus基因被廣泛應用作轉(zhuǎn)基因植物、細菌和真菌的報告基因尤其是在研究外源基因瞬時(shùnshí)表達的轉(zhuǎn)化實驗中，gus基因應用最多。共六十九頁氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(jīyīn)該基因來自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9它能夠催化乙酰基團從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到氯霉素分子上，導致(dǎozhì)氯霉素分子發(fā)生乙?；饔?，從而使其失去活性。真核細胞中不含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，無該酶的內(nèi)源活性因而該基因可作為真核細胞轉(zhuǎn)化的選擇基因及報告基因。共六十九頁3.熒光素酶基因(jīyīn)該基因有很多種，它可以催化熒光素發(fā)出熒光熒光素是熒光素酶催化的底物總稱，不同熒光素的化學結構有一定差異甚至完全不同。熒光素酶基因的活性檢測非常簡單直接將被檢的材料(cáiliào)進入加有熒光素和ATP的緩沖液中，置于暗室用肉眼直接觀察熒光，或覆蓋X-光膠片曝光，也也用熒光光度計定量檢測.共六十九頁第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定(jiàndìng)與證實第六章植物(zhíwù)基因工程共六十九頁轉(zhuǎn)化體的鑒定(jiàndìng)和證實的必要性為了驗證外源基因(jīyīn)整合到染色體.我們采用PCR技術Southern雜交技術為了驗證外源基因是否表達.我們采用RT-PCR技術Northern雜交技術.Western雜交技術共六十九頁PCR檢測外源基因(jīyīn)的整合通過設計外源基因兩端的特異引物采用PCR基因可以使外源基因得到大量擴增然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測特意擴增帶的有無(yǒuwú)，從而判斷外源基因是否整合到受體植物的基因組。優(yōu)點:由于對模板DNA的要求少，適合與轉(zhuǎn)基因體的早期檢測。缺點:容易受到外界因素的干擾。共六十九頁Southern雜交檢測外源基因(jīyīn)的整合原理:來源不同但具有互補序列的兩條多核苷酸鏈通過Waston-Crick堿基配對原則形成穩(wěn)定的結構.其中(qízhōng)一條被標記成為探針,探針與互補的核苷酸序列雜交,通過放射自顯影技術可以被檢測出來.雜交方式:Southern斑點雜交Southern印記雜交(最常用)Southern原位雜交共六十九頁RT-PCR檢測外源基因(jīyīn)的表達適用范圍:外源基因在受體細胞是否轉(zhuǎn)錄的初步檢測.原理:以轉(zhuǎn)基因個體總RNA或mRNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄,然后PCR擴增,如果可以獲得特意的cRNA擴增條帶,則表明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)錄.優(yōu)點(yōudiǎn):簡單、快速，對mRNA抽提的數(shù)量和質(zhì)量都要求不高.共六十九頁Northern雜交檢測(jiǎncè)外源基因的表達與Southern的不同是:固體膜上轉(zhuǎn)移固定的是總RNA或mRNA.探針與膜上RNA形成RNA-DNA雜交雙鏈.通過放射自顯影的強度可以判斷外源基因的表達(biǎodá)水平.分類:斑點雜交(假陽性率高.不常用)印跡雜交(比較常用)共六十九頁Western雜交檢測外源基因表達(biǎodá)的產(chǎn)物適用范圍:檢測外源基因在蛋白質(zhì)水平上的表達.原理從轉(zhuǎn)基因材料中提取總蛋白或者目的蛋白，經(jīng)SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳把蛋白質(zhì)按分子大小分離，在轉(zhuǎn)移到固體膜上，然后加入特異抗體。膜上的目的蛋白與一抗結合，再加入帶標記的二抗，最后(zuìhòu)通過二抗上的標記物的性質(zhì)進行檢測。共六十九頁第五節(jié)植物基因工程研究(yánjiū)的

應用和展望第六章植物(zhíwù)基因工程共六十九頁一抗性基因工程二植物品質(zhì)改良基因工程三植物雜種優(yōu)勢(zázhǒnɡyōushì)的利用四植物代謝工程共六十九頁一抗性基因工程(jīyīngōngchéng)研究最早