2025屆高考生物一輪復(fù)習(xí)新考案-大單元11生物技術(shù)與工程第58講基因工程的基本工具與操作程序(人教版2019)

第58講基因工程的基本工具與操作程序【課標(biāo)內(nèi)容】1．概述基因工程是在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來的；2．闡明重組DNA技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具；3．闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟?？键c(diǎn)1基因工程的基本工具考點(diǎn)落實(shí)知識1基因工程概述基因工程又叫作重組DNA技術(shù)。項(xiàng)目內(nèi)容主要技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作環(huán)境__體外__操作水平__DNA分子水平__理論依據(jù)基因重組供體提供__目的基因__受體表達(dá)目的基因基本過程切割→改造和拼接→導(dǎo)入→表達(dá)優(yōu)點(diǎn)克服__遠(yuǎn)緣雜交不親和__的障礙，定向改造生物的__遺傳性狀__知識2基因工程的基本工具1．限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)圖中可見，限制酶在識別序列中心軸線兩側(cè)切開產(chǎn)生的是__黏性末端__，在識別序列中心軸線處切開產(chǎn)生的是__平末端__。2．DNA連接酶(1)作用：在兩個(gè)核苷酸之間形成__磷酸二酯鍵__以連接兩個(gè)DNA片段。解疑釋惑限制酶和DNA連接酶的關(guān)系圖示(2)類型歸納總結(jié)與DNA有關(guān)的酶酶作用作用相關(guān)“鍵”限制酶切割DNA片段，產(chǎn)生兩個(gè)(具有相同黏性末端或平末端)DNA片段破壞磷酸二酯鍵DNA連接酶催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，從而連接起來形成磷酸二酯鍵解旋酶將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈破壞氫鍵(非化學(xué)鍵)DNA聚合酶把游離的脫氧核苷酸連接到引物或者已有的DNA單鏈的3′端上形成磷酸二酯鍵DNA(水解)酶將DNA水解為脫氧核苷酸破壞磷酸二酯鍵3．載體(1)作用：將基因送入細(xì)胞。(2)種類：質(zhì)粒、__噬菌體__、動植物病毒等。(3)重要的載體之一——質(zhì)粒①質(zhì)粒的本質(zhì)：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單，獨(dú)立于真核細(xì)胞的細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的__環(huán)狀雙鏈DNA分子__。②質(zhì)粒適于作基因載體的特點(diǎn)(載體須具備的條件)特點(diǎn)(條件)作用有一個(gè)至多個(gè)__限制酶切割位點(diǎn)__供外源DNA片段插入其中能在細(xì)胞中進(jìn)行__自我復(fù)制__，或整合到受體DNA上，隨受體細(xì)胞DNA同步復(fù)制—帶有__標(biāo)記基因__(常是人工改造后具有)，一般為抗生素抗性基因或熒光基因等便于重組DNA分子的篩選(鑒定目的基因是否導(dǎo)入成功)深度指津最常見的標(biāo)記基因——抗生素抗性基因目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞，原理如下圖所示(以氨芐青霉素抗性基因?yàn)槔?：概念思辨1．判斷下列說法的正誤：(1)目前使用的限制酶都是從原核生物中得到的。(×)提示：限制酶主要是從原核生物中得到的，目前許多已商業(yè)化生產(chǎn)。(2)質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞中的一種細(xì)胞器。(×)提示：質(zhì)粒不是細(xì)胞器。(3)重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、DNA連接酶和載體。(×)提示：重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、DNA連接酶。(4)不同的限制酶切割DNA，可能得到相同的黏性末端。(√)(5)用DNA連接酶可連接兩種來源不同的DNA。(√)(6)用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，是為了獲得相同的黏性末端，以便連接。(√)(7)限制酶的識別序列都由6個(gè)核苷酸組成。(×)提示：大多數(shù)限制酶的識別序列由6個(gè)核苷酸組成，少數(shù)由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。2．限制酶在原核生物中的作用是什么？它會不會切割自己的DNA分子？提示：原核細(xì)胞中的限制酶能夠切割入侵的外源DNA而保護(hù)自身。原核細(xì)胞中的限制酶不會切割自己的DNA分子，是因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍曰蜃约旱腄NA分子已被修飾而不被識別。3．將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來，需要切割__2__處，同時(shí)產(chǎn)生__4__個(gè)黏性末端或平末端。而切割質(zhì)粒則只需要限制酶剪切1次，因?yàn)開_質(zhì)粒是環(huán)狀DNA分子__。典題說法考向1基因工程中工具酶的選擇和利用(2010·江蘇卷)下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請回答下列問題：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ識別序列及切割位點(diǎn)eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖1))eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖2))(1)一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有__0、2__個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。(2)若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越__高_(dá)_。(3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是__SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因__。(4)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止__質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化__。(5)為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入__DNA連接__酶。(6)重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是__鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞__。解析：(1)質(zhì)粒切割前是雙鏈環(huán)狀DNA分子，所有磷酸基團(tuán)參與形成磷酸二酯鍵，故不含游離的磷酸基團(tuán)。從圖1可以看出，質(zhì)粒上只含有一個(gè)SmaⅠ的切點(diǎn)，因此被該酶切割后，質(zhì)粒變?yōu)榫€性雙鏈DNA分子，因每條鏈上含有一個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，因此切割后含有兩個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。(2)由題目可知，SmaⅠ識別的DNA序列只有G和C，而G和C之間可以形成三個(gè)氫鍵，A和T之間可以形成兩個(gè)氫鍵，所以SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性就越高。(3)質(zhì)粒抗生素抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因，由圖2可知，標(biāo)記基因和外源DNA目的基因中均含有SmaⅠ酶切位點(diǎn)，都可以被SmaⅠ破壞，故不能使用該酶剪切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA。(4)只使用EcoRⅠ，則質(zhì)粒和目的基因兩端的黏性末端相同，用DNA連接酶連接時(shí)，會產(chǎn)生質(zhì)粒和目的基因的自身連接物，而利用BamHⅠ和HindⅢ剪切時(shí)，質(zhì)粒和目的基因兩端的黏性末端不同，用DNA連接酶連接時(shí)，不會產(chǎn)生自身連接產(chǎn)物。(5)質(zhì)粒和目的基因連接后獲得重組質(zhì)粒，該過程需要DNA連接酶作用，故混合后加入DNA連接酶。(6)質(zhì)粒上的抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因，用于鑒別和篩選含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。深度指津?qū)ο拗泼盖懈钗稽c(diǎn)的三點(diǎn)要求(1)位置要求：限制酶切割位點(diǎn)所處的位置必須在標(biāo)記基因外，只有這樣才能保證標(biāo)記基因的完整性。(2)數(shù)量要求：選擇限制酶切割目的基因時(shí)，被選擇的限制酶在目的基因的兩側(cè)都要有識別序列，這樣才能切割出完整的目的基因。(3)對象要求①在獲取目的基因和切割載體時(shí)通常用同一種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但如果用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同時(shí)，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。②為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，可用不同的限制酶分別處理目的基因和載體(要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))，使目的基因兩側(cè)及載體上具有兩個(gè)不同的末端。③所選擇的限制酶不能破壞標(biāo)記基因，如質(zhì)粒上有兩個(gè)或兩個(gè)以上標(biāo)記基因，則要求至少保留一種能用于篩選。(2023·新課標(biāo)卷)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(C)eq\a\vs4\al(\x(),)A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E．coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coliDNA連接酶連接解析：酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無法進(jìn)行后續(xù)的篩選。考向2基因載體和標(biāo)記基因關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述，錯(cuò)誤的是(C)A．基因表達(dá)載體能協(xié)助目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)制B．具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便目的基因的插入C．終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使翻譯在所需要的地方停下來D．載體上常有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選解析：基因表達(dá)載體上有復(fù)制原點(diǎn)，能協(xié)助目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)制，A正確；作為載體必須具備的條件之一是具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便目的基因能夠與之結(jié)合，B正確；終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來，C錯(cuò)誤；載體上需要具有某些標(biāo)記基因，以便于重組DNA分子的篩選，D正確?？键c(diǎn)2基因工程的操作程序考點(diǎn)落實(shí)知識1基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心工作)(1)過程(2)基因表達(dá)載體的組成深度指津啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子(1)啟動子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的__DNA片段__，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)。終止子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游。(2)起始密碼子和終止密碼子位于__mRNA__上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞常用方法操作過程植物細(xì)胞(常用體細(xì)胞或受精卵)__花粉管通道法__(我國獨(dú)創(chuàng))方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房；方法二：將DNA溶液滴加在授粉后一定時(shí)間內(nèi)的花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊__農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法__將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA上→農(nóng)桿菌→感染植物細(xì)胞→T－DNA整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上→表達(dá)動物細(xì)胞(常用受精卵)__顯微注射法__將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物微生物細(xì)胞__Ca2+處理法__(感受態(tài)細(xì)胞法)Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收周圍環(huán)境中的DNA分子解疑釋惑(1)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為__轉(zhuǎn)化__。實(shí)質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法原理：農(nóng)桿菌易感染植物細(xì)胞，并將其Ti質(zhì)粒上的__T－DNA__轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞染色體DNA上。4．目的基因的檢測與鑒定(1)通過__PCR__等技術(shù)檢測目的基因是否導(dǎo)入或是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(2)利用__抗原—抗體雜交__技術(shù)檢測目的基因是否翻譯。(3)進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的抗蟲、抗病、功能活性等鑒定。知識2PCR技術(shù)1．原理：__DNA半保留復(fù)制__和DNA的熱變性。2．特點(diǎn)：可在短時(shí)間內(nèi)__大量擴(kuò)增__目的基因。3．PCR反應(yīng)所需的條件條件作用有一段已知目的基因的核苷酸序列便于合成__引物__在一定的__緩沖液__中進(jìn)行提供相對穩(wěn)定的pH環(huán)境4種脫氧核苷酸(實(shí)際上用脫氧核苷三磷酸，即dNTP)作為合成DNA子鏈的__原料__，同時(shí)提供__能量__DNA母鏈作為DNA復(fù)制的模板__耐高溫__的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)催化合成DNA子鏈引物(是一小段__短單鏈核酸__，作為DNA復(fù)制的起始序列，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對)使DNA聚合酶能夠從引物的__3′__端開始連接脫氧核苷酸4．過程及圖解循環(huán)重復(fù)上述過程，n次循環(huán)后，目的基因的量將被擴(kuò)增__2n__倍。概念思辨1．判斷下列說法的正誤：(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，兩種引物的堿基序列應(yīng)互補(bǔ)。(×)提示：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，兩種引物間的堿基序列不能互補(bǔ)。(2)目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。(√)(3)體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR過程中，都是一條鏈連續(xù)復(fù)制(前導(dǎo)鏈)，一條鏈不連續(xù)(后隨鏈)。(×)提示：PCR中，兩條子鏈都是連續(xù)合成的。(4)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，須將目的基因插入啟動子與終止子之間。(√)(5)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法常用的受體細(xì)胞是花粉細(xì)胞。(×)提示：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的受體細(xì)胞常見的是雙子葉植物和裸子植物體細(xì)胞，目前該方法在某些單子葉植物中獲得了成功。(6)目的基因必須整合到受體細(xì)胞的DNA中才能復(fù)制。(×)提示：目的基因沒有整合到受體細(xì)胞前可隨質(zhì)粒復(fù)制而復(fù)制。(7)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法實(shí)質(zhì)是將Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的染色體上。(×)提示：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法實(shí)質(zhì)是將Ti質(zhì)粒上的T－DNA(含目的基因)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的染色體上。(8)體內(nèi)DNA復(fù)制和PCR技術(shù)都需要解旋酶打開DNA雙螺旋。(×)(9)DNA復(fù)制時(shí)，子鏈延伸的方向都是從5′端到3′端。(√)2．要合成有生物活性的胰島素，為什么受體細(xì)胞最好用單細(xì)胞真核生物？提示：胰島素是分泌蛋白，形成成熟的胰島素需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌，故最好選用真核生物如酵母菌作受體細(xì)胞。3．檢測棉花中導(dǎo)入的抗蟲基因是否表達(dá)的最簡便的方法是什么？提示：通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲，來確定棉花抗蟲特性以及抗性的程度。4．自然界中生物的DNA復(fù)制和人工合成中的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之所以需要引物，是因?yàn)樵贒NA合成時(shí)DNA聚合酶只能__將游離的脫氧核苷酸連接到已有片段的3′端__合成子鏈。典題說法考向1基因表達(dá)載體的構(gòu)建(2023·常熟期中)圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，其中TetR是四環(huán)素抗性基因、AmpR是氨芐青霉素抗性基因。圖2為重組質(zhì)粒，甲、乙、丙為3種引物所在的相應(yīng)位置。下列有關(guān)敘述正確的是(A)eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖1))eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖2))A．質(zhì)粒P1經(jīng)“酶處理”后平末端轉(zhuǎn)變成黏性末端，有利于與目的基因片段的連接B．質(zhì)粒P2和目的基因片段可在DNA聚合酶或DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒C．若受體微生物能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，說明成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒P3D．用PCR鑒定篩選出的菌落中是否含正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，選擇引物甲和丙最合適解析：質(zhì)粒P1經(jīng)“酶處理”后由平末端轉(zhuǎn)變成黏性末端，黏性末端游離，易于互補(bǔ)末端碰撞，因此能提高目的基因片段和質(zhì)粒的連接效率，A正確；質(zhì)粒P2和目的基因片段可在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒，這里不需要DNA聚合酶，B錯(cuò)誤；圖示的質(zhì)粒均含有抗氨芐青霉素的基因，因此，若受體微生物能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，不能說明成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒P3，C錯(cuò)誤；用PCR鑒定篩選出的菌落中是否含正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，選擇引物乙和丙即可，因?yàn)镻CR擴(kuò)增的DNA片段是引物之間的序列，擴(kuò)增乙和丙之間的序列就包含了目的基因，D錯(cuò)誤。(2023·如皋測試)人體內(nèi)的t－PA蛋白能高效降解由纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥，改造后的t－PA蛋白能顯著降低出血副作用。如圖表示構(gòu)建含t－PA改良基因重組質(zhì)粒的過程示意圖。相關(guān)說法錯(cuò)誤的是(B)A．構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，選用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡB．需要DNA聚合酶將t－PA改良基因與質(zhì)粒連接C．新霉素抗性基因的作用是便于將導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來D．在加入新霉素的培養(yǎng)基中選擇呈白色的菌落選育工程菌株解析：根據(jù)圖中目的基因兩端的黏性末端以及各種限制酶的切割位點(diǎn)可知，在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，選用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割質(zhì)粒，才能與目的基因t－PA改良基因高效連接，A正確；將t－PA改良基因與質(zhì)粒連接的酶是DNA連接酶，不是DNA聚合酶，B錯(cuò)誤；在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，其中的新霉素抗性基因沒有被破壞，因此可以根據(jù)對新霉素的抗性將成功導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來，C正確；重組質(zhì)粒已經(jīng)破壞了mlacZ基因，其不會表達(dá)產(chǎn)物，即細(xì)胞呈白色，所以，在加入新霉素的培養(yǎng)基中選擇呈白色的菌落選育工程菌株，D正確?？枷?基因工程的操作過程(2023·海安中學(xué))四尾柵藻生長周期短、適應(yīng)性強(qiáng)，是一種高潛力生物柴油新型原料，但油脂產(chǎn)量低。研究人員從含油量高的紫蘇中提取DGAT1(催化油脂合成的關(guān)鍵酶)基因，并成功導(dǎo)入四尾柵藻細(xì)胞內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)油四尾柵藻。其制備流程如圖所示，圖中AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，LacZ基因可使細(xì)菌利用培養(yǎng)基中的物質(zhì)X－gal進(jìn)而使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，無該基因或該基因被破壞，菌落呈白色。請分析回答下列問題：(1)從含油量高的紫蘇組織細(xì)胞中提取總的RNA，在__逆轉(zhuǎn)錄__酶作用下獲得cDNA，用于PCR擴(kuò)增，該過程的原理是按__堿基互補(bǔ)配對__原則合成cDNA。(2)PCR擴(kuò)增DGAT1基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板cDNA解旋為單鏈的條件是__加熱至90℃以上(約94℃)__。在DNA延伸的過程中，使用TaqDNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是__TaqDNA聚合酶熱穩(wěn)定性高而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下失活__。(3)圖中大腸桿菌是pMD19－DGAT1的理想的受體細(xì)胞，主要原因是__大腸桿菌繁殖快(或可以短時(shí)間產(chǎn)生大量質(zhì)粒)__。構(gòu)建的pMD19－DGAT1導(dǎo)入經(jīng)__CaCl2__溶液處理的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，并接種到含__X－gal和氨芐青霉素__的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。一段時(shí)間后，挑選__白__色的菌落以提取質(zhì)粒pMD19－DGAT1。(4)用限制酶BamHⅠ和XbaⅠ切割pMD19－DGAT1和pBI121，將其連接成重組表達(dá)載體pBI121－DGAT1，并將其導(dǎo)入四尾柵藻細(xì)胞中。與單酶切相比，雙酶切的優(yōu)點(diǎn)有__BamHⅠ和XbaⅠ使DGAT1基因能定向插入表達(dá)載體__、__防止自身環(huán)化__。解析：(1)cDNA是逆轉(zhuǎn)錄獲得的，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對原則合成cDNA。PCR原理是DNA的復(fù)制，該過程遵循基因的互補(bǔ)配對原則。(2)酶大多是蛋白質(zhì)，都需要適宜的溫度發(fā)揮催化作用，普通的大腸桿菌的DNA聚合酶的最適合溫度基本不會超過40℃，但是在PCR反應(yīng)中，加熱的溫度會高達(dá)94℃，此時(shí)的普通DNA聚合酶會變性失活，無法使用，而TaqDNA聚合酶是耐熱的DNA聚合酶，可以使用。(3)大腸桿菌具有的特點(diǎn)是繁殖快、代謝旺盛、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少，是理想的轉(zhuǎn)基因材料，構(gòu)建的PMD19－DGAT1導(dǎo)入經(jīng)CaCl2溶液處理的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，含有LacZ基因的大腸桿菌可以利用培養(yǎng)物質(zhì)中的X－gal來使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，通過稀釋涂布平板法將大腸桿菌細(xì)胞接種到含氨芐青霉素和X－gal的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，LacZ基因成功表達(dá)的菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，成功導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌菌落呈現(xiàn)白色，故一段時(shí)間后，挑選白色的菌落以提取質(zhì)粒PMD19－DGAT1。(4)目的基因應(yīng)插入啟動子和終止子之間，據(jù)圖可知，兩者之間有BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，所以采用BamHⅠ和XbaⅠ進(jìn)行切割pMD19－DGAT1和pBI121。單酶切切割后的載體兩端的黏性末端相同，可能會導(dǎo)致目的基因和載體反向連接或載體、目的基因自身環(huán)化，采用雙切酶切割后的載體黏性末端不同，故可以控制外源基因插入方向，避免自身環(huán)化，提高重組效率。1．大腸桿菌的質(zhì)粒常被用來作基因工程中的載體，這與它的哪項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)有關(guān)(D)A．具有黏性末端B．分子呈環(huán)狀，便于限制酶切割C．對宿主細(xì)胞的生存有決定性作用D．分子小，能自主復(fù)制，有標(biāo)記基因解析：質(zhì)粒是環(huán)狀DNA分子，其不具有黏性末端；質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌擬核外的環(huán)狀DNA分子，其中含有限制酶的切割位點(diǎn)時(shí)才能便于限制酶切割；質(zhì)粒對宿主細(xì)胞的生存沒有決定性作用；作為載體的質(zhì)粒分子小，能自主復(fù)制，且常含有標(biāo)記基因，以便對重組后的重組DNA進(jìn)行篩選。2．某線性DNA分子含有5000個(gè)堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的識別序列和切割位點(diǎn)如圖所示。下列說法錯(cuò)誤的是(D)a酶切割產(chǎn)物(bp)b酶再次切割產(chǎn)物(bp)2100∶1400∶1000∶5001900∶200∶800∶600∶1000∶500A．在該DNA分子中，a酶與b酶的識別序列分別有3個(gè)和2個(gè)B．a(chǎn)酶與b酶切割后形成的黏性末端是相同的C．a(chǎn)酶與b酶切斷的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵D．若同時(shí)使用a酶和b酶，得到的結(jié)果和表中不同解析：a酶可以把原有DNA切成4段，說明有該DNA分子上有3個(gè)切口，即a酶的識別序列有3個(gè)；b酶把大小是2100bp的DNA切成大小分別為1900bp和200bp兩個(gè)片段，再把大小是1400bp的DNA切成大小分別為800bp和600bp兩個(gè)片段，說明b酶在該DNA分子上有2個(gè)切口，A正確。由圖可以看出，a酶和b酶切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，都為GATC—，B正確。a酶與b酶切斷的化學(xué)鍵均為連接兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，C正確。若同時(shí)使用a酶和b酶，a酶和b酶的酶切位點(diǎn)相同，故得到的結(jié)果和表中相同，D錯(cuò)誤。3．重組質(zhì)?？梢詳y帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞，則下列不一定可以說明目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的是(B)A．大腸桿菌中檢測到人胰島素基因的mRNAB．水稻細(xì)胞中檢測到氨芐青霉素抗性基因C．棉花細(xì)胞中檢測到抗棉鈴蟲基因D．鯉魚細(xì)胞中檢測到人的生長激素解析：氨芐青霉素抗性基因?qū)儆跇?biāo)記基因，水稻細(xì)胞中檢測到氨芐青霉素抗性基因不能說明目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞，也可能導(dǎo)入了空載體。4．(2023·淮安期中)在基因工程中，常采用花粉管通道法和土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞。如圖為花粉管通道法的一般原理示意圖。相關(guān)敘述正確的是(C)A．外源DNA進(jìn)入胚囊最終獲得的種子均含有目的基因B．植物生長各個(gè)時(shí)期均可通過花粉管通道導(dǎo)入外源DNAC．花粉管通道法最大的優(yōu)點(diǎn)是無需植物組織培養(yǎng)，技術(shù)簡單D．含外源DNA的種子發(fā)育成植株后均具有相應(yīng)性狀解析：外源DNA進(jìn)入胚囊，不一定能整合到染色體上，故最終獲得的種子不一定含有目的基因，A錯(cuò)誤；圖示花粉管通道法應(yīng)在雌蕊成熟時(shí)進(jìn)行操作，B錯(cuò)誤；花粉管通道法可以直接實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的自然生成，無需經(jīng)過植物組織培養(yǎng)這一過程，C正確；含外源DNA的種子發(fā)育成植株不一定具有相應(yīng)性狀，還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平等的檢測，D錯(cuò)誤。5．(多選)下列關(guān)于基因工程技術(shù)的敘述，錯(cuò)誤的是(ABC)A．切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均特異性地識別6個(gè)核苷酸序列B．PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)C．載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標(biāo)記基因D．抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá)解析：限制性內(nèi)切核酸酶大多能特異性識別6個(gè)核苷酸序列，但也有識別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成，A錯(cuò)誤；PCR中耐高溫的DNA聚合酶只是在延伸階段發(fā)揮催化作用，B錯(cuò)誤；載體質(zhì)粒上抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇，而不是抗生素合成基因，C錯(cuò)誤；目的基因?qū)肓耸荏w細(xì)胞不一定就都能正常表達(dá)，D正確。配套精練一、單項(xiàng)選擇題1．(2023·蘇州期中)下列關(guān)于基因工程基本工具的敘述，正確的是(C)A．限制性內(nèi)切核酸酶能夠識別新冠病毒特定的核苷酸序列并在特定位點(diǎn)切開磷酸二酯鍵B．EcoRⅠ識別序列和切割位點(diǎn)為G↓AATTC，則形成的黏性末端為AATTC—C．與DNA聚合酶不同，DNA連接酶發(fā)揮作用時(shí)不需要DNA模板D．用作分子運(yùn)輸車的質(zhì)粒常有特殊的抗生素合成基因，便于重組DNA分子的篩選解析：限制性內(nèi)切核酸酶只能識別DNA，而新冠病毒的核酸是RNA，A錯(cuò)誤；EcoRⅠ識別序列為GAATTC，切割點(diǎn)是G和A之間的磷酸二酯鍵，DNA的兩條鏈都是這樣切割，所以形成的黏性末端為AATT，B錯(cuò)誤；與DNA聚合酶不同，DNA連接酶發(fā)揮作用時(shí)不需要DNA模板，C正確；用作分子運(yùn)輸車的質(zhì)粒常有特殊的抗生素抗性基因，便于重組DNA分子的篩選，D錯(cuò)誤。2．(2024·淮安調(diào)研)基因工程中需使用多種工具酶，幾種限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列說法正確的是(B)A．限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可以通過E．coliDNA連接酶相互連接B．DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成C．限制酶EcoRⅠ進(jìn)行一次切割，會切斷2個(gè)磷酸二酯鍵，形成1個(gè)游離的5′末端D．若兩種限制酶的識別序列相同，則形成的末端一定能通過DNA連接酶相互連接解析：限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E．coliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，但連接效率較低，A錯(cuò)誤；DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵，RNA聚合酶將單個(gè)核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵，B正確；一個(gè)限制酶切割一次，使DNA雙鏈斷開，會有兩個(gè)磷酸二酯鍵斷裂，形成2個(gè)黏性末端或平末端，形成2個(gè)游離的5′末端，C錯(cuò)誤；若兩種限制酶的識別序列相同，但由于識別的位點(diǎn)不同，切割形成的末端不同，故不一定能通過DNA連接酶相互連接，D錯(cuò)誤。3．下列有關(guān)重組DNA技術(shù)的基本工具的敘述，正確的是(B)A．限制酶能夠識別RNA分子的特定核苷酸序列B．?dāng)y帶外源DNA片段的質(zhì)?？稍谑荏w細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制C．DNA連接酶不能連接雙鏈DNA片段的平末端D．DNA連接酶能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵解析：限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定的堿基之間切開磷酸二酯鍵，A錯(cuò)誤；攜帶外源DNA片段的質(zhì)?？稍谑荏w細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，質(zhì)?？梢宰鳛槟康幕虻妮d體，B正確；T4DNA連接酶能連接雙鏈DNA片段的平末端，C錯(cuò)誤；DNA連接酶能夠連接雙鏈DNA片段，形成磷酸二酯鍵，氫鍵自動生成，D錯(cuò)誤。4．用EcoRⅠ和HindⅢ兩種限制酶處理同一DNA片段(限制酶在對應(yīng)切點(diǎn)一定能切開)，酶切位點(diǎn)及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖所示。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(B)eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖1))eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖2))A．圖1中兩種限制酶識別的脫氧核苷酸序列不同B．圖1中的兩種限制酶與解旋酶均可作用于氫鍵C．圖2中的泳道1可能是HindⅢ作用后得到的酶切產(chǎn)物D．若同時(shí)用EcoRⅠ和HindⅢ處理該DNA，電泳后得到4種產(chǎn)物解析：圖1中含有2個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)，可以得到3段酶切產(chǎn)物，因此圖2中1條帶可能為HindⅢ酶切的結(jié)果，2條帶可能為EcoRⅠ酶切的結(jié)果，兩種限制酶識別的脫氧核苷酸序列不同，A、C正確；限制酶破壞的是磷酸二酯鍵，解旋酶破壞的是氫鍵，B錯(cuò)誤；據(jù)圖1可見，若同時(shí)用EcoRⅠ和HindⅢ處理該DNA，電泳后得到4個(gè)不同的DNA片段，即4種產(chǎn)物，D正確。5．(2023·重慶卷)某小組通過PCR(假設(shè)引物長度為8個(gè)堿基短于實(shí)際長度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是(B)eq\a\vs4\al(,)A．其中一個(gè)引物序列為5′－TGCGCAGT－3′B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC．用步驟①的酶對載體進(jìn)行酶切，至少獲得了2個(gè)片段D．酶切片段和載體連接時(shí)，可使用E．coliDNA連接酶或T4DNA連接酶解析：由于引物只能引導(dǎo)子鏈從5′到3′，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，其中一個(gè)引物序列為5′－TGCGCAGT－3′，另一個(gè)引物序列為5′－AGCTAGCA－3′，A正確；根據(jù)三種酶的酶切位點(diǎn)，左側(cè)的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右邊的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B錯(cuò)誤；步驟①用到兩種限制酶切割，這兩種限制酶的識別序列不同，載體一般為環(huán)狀，且載體中至少含有1個(gè)限制酶NheⅠ的識別序列，至少有1個(gè)CfoⅠ的識別序列，因此用步驟①的酶對載體進(jìn)行酶切，至少獲得了2個(gè)片段，C正確；圖中形成的是黏性末端，而E．coliDNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端，D正確。6．如表為四種限制酶所識別的核苷酸序列及相應(yīng)的切割位置(箭頭所指)，下列敘述正確的是(C)限制酶種類序列及切點(diǎn)①EcoRⅠ5′－G↓AATTC－3′3′－CTTAA↑G－5′②BamHⅠ5′－G↓GATCC－3′3′－CCTAG↑G－5′③BglⅡ5′－A↓GATCT－3′3′－TCTAG↑A－5′④NotⅠ5′－GC↓GGCCGC－3′3′－CGCCGG↑CG－3′A．①②③④可催化磷酸二酯鍵和氫鍵斷裂，形成黏性末端B．①切出的DNA片段，只有用E．coli連接酶才能連接起來C．②③切出的末端連接后形成的片段，不能再被②或③識別切割D．構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，用②③進(jìn)行雙酶切，可防止目的基因與載體的反向連接解析：①②③④均為限制酶，它們可催化磷酸二酯鍵斷裂，但不能催化氫鍵斷裂，且均形成黏性末端，A錯(cuò)誤；①切出的DNA片段帶有黏性末端，用E．coliDAN連接酶和T4DNA連接酶均能連接起來，B錯(cuò)誤；②③切出的黏性末端相同，用DNA連接酶連接后形成的片段的堿基序列為eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(5′－GGATCT－3′,3′－CCTAGA－5′))，不能再被②或③識別切割，C正確；構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，用②③進(jìn)行雙酶切，不能防止目的基因與載體的反向連接，因?yàn)檫@兩種限制酶切出的黏性末端是相同的，D錯(cuò)誤。7．下列關(guān)于限制酶和DNA連接酶的敘述，正確的是(B)A．兩者都是從原核生物中分離純化出來的B．兩者的催化都會導(dǎo)致磷酸二酯鍵數(shù)目的改變C．限制酶都能在特定位點(diǎn)切割產(chǎn)生黏性末端D．DNA連接酶與DNA聚合酶作用的底物是相同的解析：限制酶主要來自原核生物，DNA連接酶來自大腸桿菌和噬菌體，A錯(cuò)誤；兩者的催化都會導(dǎo)致磷酸二酯鍵數(shù)目的改變，限制酶使磷酸二酯鍵數(shù)目減少，DNA連接酶使磷酸二酯鍵數(shù)目增多，B正確；限制酶都能在特定位點(diǎn)切割產(chǎn)生黏性末端或平末端，C錯(cuò)誤；DNA連接酶與DNA聚合酶作用的底物不同，前者是兩個(gè)DNA片段，后者是單個(gè)脫氧核苷酸，D錯(cuò)誤。8．為獲得突變體，科研人員通常將T－DNA插入野生型個(gè)體的某些基因中(如圖)。使用PCR技術(shù)確定T－DNA的插入位置，應(yīng)選擇的引物組合是(C)A．引物1和引物3 B．引物1和引物2C．引物2和引物3 D．以上均不適合解析：引物3延伸的方向向左，引物1和引物2引物延伸的方向向右，引物組合只能是1和3，或2和3，完整的T－DNA過大，不能完成PCR，故選引物2和3。9．如圖表示PCR過程中某個(gè)階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是(D)A．②鏈從L到R的方向?yàn)?′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板B．PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制C．以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個(gè)引物③D．物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物解析：根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行關(guān)系可判斷，②鏈從L到R的方向?yàn)?′→3′，圖中①②鏈均可作為子鏈合成的模板，A錯(cuò)誤；PCR過程需要通過高溫處理使雙鏈中氫鍵斷裂成為單鏈，而后通過降溫使子鏈和引物之間形成雙鏈結(jié)構(gòu)，而后調(diào)節(jié)溫度使子鏈沿著引物的3′端延伸，B錯(cuò)誤；以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23＝8，則需消耗引物③的數(shù)目為2n+1－2＝24－2＝14個(gè)，C錯(cuò)誤；物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得以該序列為模板合成的雙鏈DNA產(chǎn)物，D正確。10．癌癥患者進(jìn)行化療或放療之后，體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量大幅度降低，可以注射粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM－CSF)增加白細(xì)胞的數(shù)量。在自然條件下，此細(xì)胞因子的含量很低，很難獲得。某科研團(tuán)隊(duì)將人的GM－CSF基因?qū)氪竽c桿菌，大量生產(chǎn)重組GM－CSF，滿足了臨床需求。下列有關(guān)敘述正確的是(A)A．可通過PCR的方法獲取GM－CSF基因B．構(gòu)建GM－CSF基因表達(dá)載體需要限制酶和DNA聚合酶C．基因表達(dá)載體上的復(fù)制原點(diǎn)可以調(diào)控GM－CSF基因的表達(dá)D．可通過顯微注射的方式將GM－CSF基因?qū)氪竽c桿菌解析：人的GM－CSF基因可以從人的基因文庫中獲得，或從表達(dá)GM－CSF基因的細(xì)胞中提取相應(yīng)的mRNA再逆轉(zhuǎn)錄獲得，或PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得，或人工化學(xué)合成獲得，A正確；構(gòu)建GM－CSF基因表達(dá)載體需要限制酶和DNA連接酶，DNA復(fù)制時(shí)需要DNA聚合酶，B錯(cuò)誤；基因表達(dá)載體上的復(fù)制原點(diǎn)可以啟動復(fù)制過程，啟動子和終止子可以調(diào)控GM－CSF基因的表達(dá)，C錯(cuò)誤；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣，將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞最有效的方法是顯微注射法，將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法，D錯(cuò)誤。二、多項(xiàng)選擇題11．下表為常用的限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點(diǎn)，由此推斷，以下說法正確的是(ABC)限制酶名稱識別序列和切割位點(diǎn)限制酶名稱識別序列和切割位點(diǎn)BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGGA．HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B．Sau3AⅠ限制酶的切割位點(diǎn)在識別序列的外部C．BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D．一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列解析：HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端，A正確；限制酶的切割位點(diǎn)可能在序列內(nèi)部，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、HindⅡ、SmaⅠ，也可能在序列外部，如Sau3AⅠ，B正確；不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3AⅠ，C正確；HindⅡ可以識別多種核苷酸序列，D錯(cuò)誤。12．自然界中很少出現(xiàn)藍(lán)色的花，天然藍(lán)色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細(xì)胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍(lán)色。我國科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(BC)注：PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ為不同限制酶。A．上述獲得藍(lán)色玫瑰的方案中無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因B．將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠC．sfp和idgS基因表達(dá)時(shí)以DNA的同一條鏈為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄D．農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到白玫瑰染色體DNA上解析：根據(jù)題意，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)導(dǎo)入白玫瑰后，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)，所以無需轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，則會將終止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B錯(cuò)誤；sfp和idgS基因具有各自的啟動子，其轉(zhuǎn)錄的方向不同，因此，sfp和idgS基因表達(dá)時(shí)以DNA的兩條鏈為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，C錯(cuò)誤；將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞可采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，故農(nóng)桿菌可將Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到白玫瑰染色體DNA上，D正確。13．(2023·揚(yáng)州中學(xué))基因工程是一種DNA操作技術(shù)，其表達(dá)載體的構(gòu)建和檢測篩選是兩個(gè)重要步驟。圖1為某種質(zhì)粒簡圖，箭頭所指分別為限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。已知目的基因X的兩端分別有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。圖2表示運(yùn)用影印培養(yǎng)法(指在一系列平板培養(yǎng)基的相同位置上接種并培養(yǎng)出相同菌落的一種微生物培養(yǎng)方法)檢測表達(dá)載體是否導(dǎo)入大腸桿菌。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(CD)eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖1))eq\o(\s\up7(),\s\do5(圖2))A．同時(shí)使用EcoRⅠ和BamHⅠ切割質(zhì)粒，可避免酶切后質(zhì)粒的自身環(huán)化B．轉(zhuǎn)化方法是將質(zhì)粒表達(dá)載體溶于緩沖液后與經(jīng)Ca2+處理的大腸桿菌混合C．培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別含有四環(huán)素和青霉素D．從篩選結(jié)果分析，含目的基因X的菌落是1、2、3、5解析：為避免酶切后質(zhì)粒的自身環(huán)化，可同時(shí)使用EcoRⅠ和BamHⅠ切割質(zhì)粒，A正確；轉(zhuǎn)化方法是將質(zhì)粒表達(dá)載體溶于緩沖液后與經(jīng)Ca2+處理的大腸桿菌混合，B正確；用EcoRⅠ和BamHⅠ兩種限制酶對質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)，會破壞四環(huán)素抗性基因，但不會破壞青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能在含有青霉素的培養(yǎng)基上生存，但不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存，導(dǎo)入空白質(zhì)粒的大腸桿菌在含有青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上均能生存，未導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌在含青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上均不能生存，所以培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別含有青霉素、四環(huán)素，含目的基因X的菌落是4和6，C、D錯(cuò)誤。三、非選擇題14．(2023·南京江寧期末改編)干燥綜合征(SS)是一種自身免疫病，患者血清中存在多種抗體，其中SSB抗體特異性最強(qiáng)?？蒲腥藛T為生產(chǎn)SSB抗體的檢測試劑，利用基因工程獲得重組SSB蛋白，流程如下，請回答：注：XhoⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ表示限制酶，Kanr、cat分別表示卡那霉素抗性基因和氯霉素抗性基因。(1)為與PET41a質(zhì)粒連接，獲得的目的基因A兩端要含有__BamHⅠ和XhoⅠ__(寫出限制酶名稱)酶切位點(diǎn)。DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是__磷酸二酯鍵__。(2)獲得含SSB基因的重組質(zhì)粒后，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)切割原質(zhì)粒和重組質(zhì)粒，獲得片段大小見表格(1kb＝1000堿基對)，分析數(shù)據(jù)，計(jì)算可得SSB基因的長度為__3kb__。與人基因組文庫中的SSB基因相比，通過①過程獲得的SSB基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)__無__(選填“有”或“無”)啟動子、終止子和內(nèi)含子等非編碼序列。限制酶EcoRⅠBamHⅠ和XhoⅠ原質(zhì)粒8.1kb2.7kb、5.4kb重組質(zhì)粒3.4kb、5.0kb未做該處理(3)②過程目的是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入用__Ca2+__處理過的大腸桿菌內(nèi)，并接種于添加__卡那霉素__的培養(yǎng)基上，收集菌落進(jìn)行鑒定，將陽性菌落進(jìn)一步純化后再將菌體破碎處理，篩選得到重組SSB蛋白。解析：(1)據(jù)圖可知，質(zhì)粒中存在限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ和XhoⅠ識別序列，因?yàn)槟康幕蛑写嬖谙拗泼窫coRⅠ識別序列，因此不能用限制酶EcoRⅠ切割，因此質(zhì)粒只能用BamHⅠ和XhoⅠ切割。DNA連接酶將DNA片段進(jìn)行連接，