第六、七章農(nóng)藥、獸藥殘留分析

共一百三十五頁共一百三十五頁課后復(fù)習(xí)食品添加劑食品添加劑的要求與規(guī)定甜味劑種類分光光度法測定(cèdìng)環(huán)己基氨基磺酸鈉原理防腐劑分類食品抗氧化劑、人工合成抗氧化劑食品著色劑，我國允許的有九種新紅羊毛法原理共一百三十五頁共一百三十五頁本世紀(jì)對食品安全性影響最為突出的事件(shìjiàn)，當(dāng)推有機合成農(nóng)藥的發(fā)明、大量生產(chǎn)和使用。例如曾被廣泛應(yīng)用的高效殺蟲劑滴滴涕，滴滴涕對于消滅傳播瘧疾、班疹傷寒等嚴(yán)重傳染性疾病的媒介昆蟲（蚊、虱）以及防治多種頑固性農(nóng)業(yè)害蟲方面，都顯示了極好的效果，成為當(dāng)時人類防病、治蟲的強有力武器。(遠(yuǎn)離毒素、極端事例)瑞士科學(xué)家PaulMuller因此巨大貢獻(xiàn)而獲1948年諾貝爾獎。共一百三十五頁共一百三十五頁在日本(rìběn)遭下架的中國青刀豆共一百三十五頁水胺硫磷甲基對硫磷0．95ｍｇ／ｋｇ，三氟氯氰菊酯0．24ｍｇ／ｋｇ，氯氰菊酯1．89ｍｇ／ｋｇ等。共一百三十五頁共一百三十五頁食品中農(nóng)藥殘留指使用后殘存于食品中的微量農(nóng)藥，包括農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解(jiànɡjiě)物和雜質(zhì)。農(nóng)藥最大殘留限量（MRL）：在食品或農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)部或表面法定允許的農(nóng)藥最大濃度。農(nóng)藥再殘留限量(EMRL)：一些持久性農(nóng)藥雖已禁用，但還長期存在環(huán)境中，從而再次在食品中形成殘留。有機氯、有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯。特點：殘留量低；基底成分復(fù)雜、干擾多。共一百三十五頁農(nóng)藥(nóngyào)殘留分析農(nóng)藥殘留分析的基本步驟(bùzhòu)：樣品的采集與制備提取凈化濃縮色譜分析共一百三十五頁樣品(yàngpǐn)的采集與制備（一）樣品的采集的要求1.樣品要有代表性2.滿足(mǎnzú)分析精密度的要求共一百三十五頁樣品(yàngpǐn)的采集與制備（二）常見(chánɡjiàn)的采樣方法1.對角線法*共一百三十五頁樣品的采集(cǎijí)與制備2.交叉(jiāochā)法××××××××××××××××共一百三十五頁樣品的采集(cǎijí)與制備3.棋盤(qípán)法××××××××××××××共一百三十五頁樣品(yàngpǐn)的采集與制備（三）樣品的制備：樣品的制備要考慮樣品的性質(zhì)、相態(tài)及穩(wěn)定性等因素，四分法縮分。1）土壤樣品：去雜（石頭、雜草），再風(fēng)干過篩2）蔬菜樣品：組織搗碎機搗碎3）肉制品：絞肉機絞碎后，再混勻4）液體樣品：混勻，去掉漂浮物、沉淀、泥土，用量具器皿(qìmǐn)量?。ㄈ纾阂埔汗堋⒘客玻┕惨话偃屙摌悠返牟杉?cǎijí)與制備（四）樣品的保存樣品通常保存在-18℃冰柜中，一般不超過半年。注意：樣品保存要標(biāo)明：采樣人，采樣時間(shíjiān)、地點、采樣部位共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法（一）定義：提取(tíqǔ)（extration）是用物理的或化學(xué)的手段破壞待測組分與樣品成分間的結(jié)合力，將待測組分從樣品中釋放出來并轉(zhuǎn)移到易分析的溶液狀態(tài)的一個操作過程。提取要考慮以下問題：1）.樣品的性質(zhì)（相態(tài)、糖分、脂肪、水分）2）.被測成分的性質(zhì)（物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)）3）.提取溶劑的極性共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法（二）提取溶劑1.極性根據(jù)“相似(xiānɡsì)相溶”的原則選擇溶劑。一般溶劑的極性大小順序為：石油醚＜正己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜苯＜乙醚＜二氯甲烷＜乙酸乙酯＜吡啶＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜乙腈＜甲酸共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法（三）農(nóng)藥(nóngyào)的極性辛硫磷＜甲拌磷＜乙拌磷＜對硫磷＜甲基對硫磷＜倍硫磷＜?xì)⒚桑捡R拉硫磷＜亞胺硫磷＜對氧磷＜敵敵畏＜內(nèi)吸磷＜樂果＜敵百蟲＜氧化樂果＜磷胺＜甲胺磷共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法（四）提取方法1.組織搗碎法（homogenization）又稱勻漿提取法。一般將樣品（固體(gùtǐ)樣品先預(yù)絞碎）和3-5倍樣品體積的溶劑加入搗碎杯，通過高速勻漿（＞10,000r/min）2-3min，使溶劑與樣品的微粒緊密接觸、混合，將待測組分從固體(gùtǐ)樣品中快速溶出。將樣品過濾，殘渣重復(fù)提取2-3次，合并提取液，進(jìn)行凈化。共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法2.振蕩法（shaking）將樣品（固體樣品先勻漿）和適量溶劑加入碘價瓶中，中速振蕩30min，溶液(róngyè)過濾，濾渣用溶劑洗滌2-3次，合并提取液，凈化。（注：為了提高添加回收率，常常加入氯化鈉等鹽類）共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法3.索氏提取法（Soxhlexextration）又稱完全提取法，使用索氏提取器進(jìn)行提取。提取時間一般為4-8小時。方法優(yōu)點：操作簡便，不需要轉(zhuǎn)移樣品(yàngpǐn)，提取效率高。缺點：1）適用于水分含量低的樣品2）對熱穩(wěn)定的農(nóng)藥共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法4.超聲波輔助提取（sonication-assistedextration,SAE）該技術(shù)是由Johnson等于1967年提取的。通過空化作用使分子運動加快，同時將超聲波的能量傳遞(chuándì)給樣品，使組分脫附和溶解加快。操作中將樣品和溶劑放入錐形瓶中，超聲提取15-20min。共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法5.超臨界流體萃?。╯uppercriticalfluidextration，SFE）SFE于20世紀(jì)80年代開始(kāishǐ)用于環(huán)境和殘留分析。當(dāng)溫度和壓力超過臨界點時，物質(zhì)的狀態(tài)既不是氣態(tài)也不是液態(tài)，而是兼有兩者性質(zhì)的特殊狀態(tài)即超臨界流體狀態(tài)。一般選擇二氧化碳作為SFE的淋洗劑。共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法6.化學(xué)法主要用于常規(guī)方法無法提取的樣品和在酸堿穩(wěn)定的農(nóng)藥（如：動物產(chǎn)品中的六六六、DDT、狄氏劑、異狄氏劑和艾氏劑等）1）酸法（主要用于六六六、DDT等農(nóng)藥分析）試劑：高氯酸：冰醋酸=1：1（V：V）溫度(wēndù)：一般控制在80℃時間：25-30min共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法2）堿法（主要用于狄氏劑、異狄氏劑和艾氏劑等農(nóng)藥分析(fēnxī)）試劑：10%的乙醇鉀（氫氧化鉀溶于乙醇中）溫度：60℃共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法7.其它方法1）加速溶劑萃?。╝ccelerated-solventextraction,ASE）2）微波(wēibō)輔助萃取（microwave-assistedextration,MAE）共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法（五）提取效率提取效率是考察提取效果的首要指標(biāo)考察提取效率的準(zhǔn)確方法有：1.同位素標(biāo)記(biāojì)試驗2.添加回收率實驗共一百三十五頁提取(tíqǔ)方法(六)添加(tiānjiā)回收率實驗設(shè)計MRL值（maximumresiduelimit）最大允許殘留限量，單位：mg/kg以毒死蜱為例：MRL值為0.1mg/kg，則添加回收率實驗設(shè)計為三個濃度，分別為：1.0mg/kg，0.1mg/kg和0.01mg/kg每一濃度的添加回收率要求達(dá)到100+20%共一百三十五頁凈化(jìnghuà)（一）定義在提取過程中，許多與待測組分溶解性相似的雜質(zhì)（如：蛋白質(zhì)、糖類、色素等）將被一起轉(zhuǎn)移出來，這些物質(zhì)會干擾待測組分的分析。利用待測組分與雜質(zhì)物理或化學(xué)性質(zhì)的不同，而將其分離(fēnlí)的過程稱為凈化（cleanup）。共一百三十五頁凈化(jìnghuà)（二）凈化的方法1.柱層析法（columnchromatography）原理：將提取濃縮液（含農(nóng)藥與雜質(zhì)）通過一根適宜的吸附柱，然后用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砹芟?。通常農(nóng)藥一般先被淋洗出來(chūlái)，而脂肪、色素等雜質(zhì)持留在吸附柱上，從而達(dá)到分離凈化的目的。共一百三十五頁凈化(jìnghuà)常用的吸附劑1）.弗羅里硅土（Florisil）又稱硅鎂吸附劑，主要(zhǔyào)用于極性化合物的凈化

Florisil的活化：取Florisil于坩堝中，在650℃下加熱3-4h，用前在135℃的烘箱中加熱過夜。

處理后的Florisil貯藏在干燥器中，其活性能保持4d共一百三十五頁凈化(jìnghuà)Florisil活性測定：取2.0g活化(huóhuà)好的Florisil放入250ml碘價瓶中，加入20.0ml月桂酸溶液（內(nèi)含月桂酸400毫克），振蕩15min，待吸附劑下沉后，用移液管移出10.0ml溶液至另一250ml錐形瓶中，加入50ml乙醇和3滴酚酞指示劑，用0.05mol/L的氫氧化鈉溶液滴定，求出1.0gFlorisil吸附的月桂酸毫克數(shù)，即月桂酸值，以LA表示。Florisil的LA值一般在110以上共一百三十五頁凈化(jìnghuà)2）.氧化鋁（alumina）也是重要的一種吸附劑，價格便宜，有酸性、中性和堿性之分。由于農(nóng)藥在堿性條件下易于分解，故一般用中性較多。氧化鋁的活化方法與Florisil相同。由于氧化鋁的活性比Florisil大，所以(suǒyǐ)在用前要進(jìn)行減活處理。方法是：在活化好的氧化鋁中加入5%-10%重量的蒸餾水，混勻后倒入瓶中，蓋好蓋子，放置過夜即可。共一百三十五頁凈化(jìnghuà)3）.硅膠（silicagel）是硅酸鈉溶液中加入鹽酸(yánsuān)而制得的溶膠沉淀物，經(jīng)部分脫水后而得的無定形多孔固體硅膠。它能有效地去除糖類等雜質(zhì)。硅膠的活化：一般在110℃，不要超過220℃。共一百三十五頁凈化(jìnghuà)4）.活性炭（activecarbon）活化：取活性炭于燒杯中，加入(jiārù)濃鹽酸，在沸騰條件下加熱1h，冷卻，用蒸餾水洗滌至中性，在135℃下烘干即可。活性炭對植物色素具有很好的吸附作用，由于對農(nóng)藥的吸附能力也很大，故一般不能單獨使用，經(jīng)常與Florisil及氧化鋁配合使用。共一百三十五頁凈化(jìnghuà)2.液液分配（liquid-liquidextraction）又稱液液提取。其原理是根據(jù)農(nóng)藥在所選擇的溶劑對中的溶解度不同而進(jìn)行的。假設(shè)有質(zhì)量為m的農(nóng)藥存在(cúnzài)于非極性相中的分?jǐn)?shù)為p，存在(cúnzài)于極性相中的分?jǐn)?shù)為q，則：K=p/q，p+q=1假設(shè)α=非極性溶劑的體積/極性溶劑的體積對于不等體積的多次萃取共一百三十五頁凈化(jìnghuà)E非=[α×p/(1-p+α×p)]nE極=[(1-p)/(1-p+α×p)]nE非為多次提取后農(nóng)藥在非極性溶劑(róngjì)中的分?jǐn)?shù)E極為多次提取后農(nóng)藥在極性溶劑中的分?jǐn)?shù)n為提取次數(shù)共一百三十五頁凈化(jìnghuà)3.固相萃取（solid-phaseextraction,SPE）SPE的凈化機制和淋洗操作與柱層析之間不存在原則性的區(qū)別。SPE常使用預(yù)制的裝有各種(ɡèzhǒnɡ)填料的可棄小柱，SPE固定相與HPLC相似，一般專為樣品前處理設(shè)計，粒徑較大，一般在40um以上，易于操作，并且為一次性使用。

共一百三十五頁凈化(jìnghuà)SPE的優(yōu)點：1）樣品(yàngpǐn)用量?。?）溶劑用量小，一般在20ml左右；3）選擇性高，速度快，可實現(xiàn)自動化；4）凈化效果好共一百三十五頁凈化(jìnghuà)SPE操作一般有四步，即：固定相活化、樣品上柱、洗滌和洗脫。1）活化是為了創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境和除去柱內(nèi)的雜質(zhì)(zázhì)。一般先使用一種強洗脫能力的溶劑潤濕和凈化SPE柱，然后再用弱洗脫能力的溶劑平衡SPE柱。一般每100mg固定相用1-2ml溶劑平衡。在活化過程中和上樣之前不要讓柱內(nèi)液體流干和空氣進(jìn)入，以免柱床出現(xiàn)裂縫，影響凈化效果。共一百三十五頁凈化(jìnghuà)2）樣品上柱1只SPE柱的容量一般為固定相的1%-3%。流速(liúsù)越低，凈化效果越好。一般用3-10ml/min3）洗滌和洗脫共一百三十五頁凈化(jìnghuà)4.凝膠滲透色譜法（gelpermeationchromatography,GPC）凝膠滲透色譜是利用多孔的凝膠聚合物將組分按分子大小選擇性分離。分子量大的組分由于要沿凝膠顆粒間的空隙移動，遷移路徑(lùjìng)較短，先流出色譜柱；分子量小的組分由于擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，遷移路徑(lùjìng)較長，后流出色譜柱。由于農(nóng)藥分子量一般不超過400，因此很容易去除蛋白質(zhì)、核酸、脂類和色素等雜質(zhì)。共一百三十五頁凈化(jìnghuà)

常用的凝膠固定相為(xiānɡwéi)SephadexLH-20,這是一種改性的交聯(lián)葡聚糖凝膠，能在各種有機溶劑中溶脹。類似的固定相有：Bio-beadsSX-2、SX-3方法優(yōu)點：GPC柱可重復(fù)使用，速度快，成本低，可實現(xiàn)自動化。共一百三十五頁凈化(jìnghuà)5.基質(zhì)固相分散技術(shù)(jìshù)（matrixsolid-phasedispersion,MSPD）MSPD是Barker等1989年提取并給與理論解析的一種樣品快速前處理技術(shù)。將樣品直接與適量分散劑混合研磨，使樣品均勻的分散于固定相顆粒表面，制成半固態(tài)裝柱，然后進(jìn)行洗滌洗脫。樣品與分散劑的比例一般為1：4（0.5g樣品：2.0g分散劑）共一百三十五頁濃縮(nónɡsuō)

經(jīng)過洗滌洗脫的液體體積(tǐjī)一般較大，需要進(jìn)行濃縮定容。常用的儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，氮吹儀定容技術(shù)：1）含有揮發(fā)性物質(zhì)的定容技術(shù)

2）不含有揮發(fā)性物質(zhì)的定容技術(shù)共一百三十五頁色譜分析(sèpǔfēnxī)有機磷農(nóng)藥(nóngyào)的色譜分析----GC/FPD有機氯和擬除蟲菊酯類----GC/ECD氨基甲酸酯類------------GC/NPD，HPLC農(nóng)藥多殘留分析----------GC/MS，LC/MS共一百三十五頁共一百三十五頁農(nóng)藥(nóngyào)速測技術(shù)酶抑制法免疫分析(fēnxī)技術(shù)共一百三十五頁酶抑制(yìzhì)法原理

農(nóng)藥(nóngyào)（殺蟲劑）

有機磷農(nóng)藥

氨基甲酸酯類農(nóng)藥

有機氯農(nóng)藥

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥酶抑制法共一百三十五頁酶抑制(yìzhì)法原理乙酰膽堿是膽堿能神經(jīng)傳導(dǎo)(chuándǎo)的一種重要介質(zhì)，在正常生理情況下被體內(nèi)的膽堿酯酶分解成為膽堿和乙酸。反應(yīng)式為：CH3COOCH2CH2N+(CH3)3AChEHOCH2CH2N+(CH3)3+CH3COOH共一百三十五頁酶抑制(yìzhì)法原理

有機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)入機體以后則與膽堿酯酶結(jié)合形成了不易水解的磷酰化膽堿酯酶，喪失了水解乙酰膽堿的活力，如果大多數(shù)膽堿酯酶都轉(zhuǎn)變?yōu)橄喈?dāng)穩(wěn)定難以水解的磷?；憠A酯酶，乙酰膽堿就在體內(nèi)大量蓄積產(chǎn)生遲發(fā)性神經(jīng)毒性使中樞神經(jīng)、交感神經(jīng)、運動神經(jīng)和一些腺體首先興奮而活動增強，引起運動失調(diào)等，最后轉(zhuǎn)入抑制(yìzhì)和衰竭、癱瘓甚至中毒死亡。

共一百三十五頁酶抑制(yìzhì)法原理

酶抑制法檢測農(nóng)產(chǎn)品中有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留是根據(jù)有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的毒理特性對酶分解(fēnjiě)底物的抑制作用而建立起來的，使用較多的是乙酰膽堿酯酶。共一百三十五頁酶抑制(yìzhì)法原理

有機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥可以抑制乙酰膽堿酯酶的活性，使其分解乙酰膽堿的速度變慢或停止，利用這一反應(yīng)特性，用濾紙片或電極作為載體，將乙酰膽堿酯酶吸附在上面，加入顯色劑，如果酶的活性沒有被抑制，則生成的產(chǎn)物可以使顯色劑顯色，如果被測樣品中含有農(nóng)藥殘留(cánliú)則酶活性被抑制不能生成水解產(chǎn)物，顯色劑不顯色，根據(jù)顏色的變化或測定酶與某種特定化合物反應(yīng)的物理化學(xué)信號的變化，可判斷是否存在有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥。共一百三十五頁酶抑制(yìzhì)法原理

AChEI(CH3)3N+CH2CH2SOCCH3+H2OI(CH3)3N+CH2CH2SH+CH3COOH

碘化硫代膽堿與5,5’—二硫雙硝基苯甲酸（DTNB）作用(zuòyòng)生成5—巰基—2—硝基苯甲酸(黃色)，用溶液吸光度測出乙酰膽堿酯酶的催化活度。

共一百三十五頁酶抑制法---檢測(jiǎncè)方法1、比色法將果蔬樣品提取液與膽堿酯酶作用，以碘化硫代乙酰膽堿為底物，5,5’—二硫雙硝基苯甲酸為顯色劑，經(jīng)一定時間反應(yīng)后，在410nm波長下比色，根據(jù)吸光值的變化計算膽堿酯酶的抑制率，從而判斷農(nóng)藥(nóngyào)殘留是否超標(biāo)。比色法具有較高的可靠性和靈敏性，且操作簡單，測定快速，是目前常用的方法，很適合于水中和市售新鮮蔬菜的農(nóng)殘快速檢測，檢測限在0.029～10mg/kg。共一百三十五頁酶抑制(yìzhì)法—檢測方法抑制率的計算抑制率（%）=[（⊿Ao-⊿At)/⊿Ao]×100⊿Ao---對照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；⊿At----樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值當(dāng)抑制率≥50%時，表示樣品中含有(hányǒu)有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥。陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗2次以上共一百三十五頁共一百三十五頁酶抑制法---檢測(jiǎncè)方法2、試紙法將從敏感生物體內(nèi)提取的膽堿酯酶和乙酰膽堿類似物2,6—二氧靛酚乙酸酯分別固定到濾紙上。如果樣品中不含有有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，則靛酚乙酸酯在膽堿酯酶的催化下生成藍(lán)色靛酚。當(dāng)樣品中含有有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，乙酰膽堿酯酶則與其結(jié)合，失去了催化靛酚乙酸酯的能力。因此，靠目測(mùcè)有無藍(lán)色出現(xiàn)即可判斷是否含有農(nóng)藥殘留。這種方法的檢出限為0.3～10mg/kg。共一百三十五頁酶抑制(yìzhì)法---檢測方法3、酶傳感器法生物傳感器是目前現(xiàn)場檢測技術(shù)中的研究熱點，它根據(jù)生物敏感部件與特定(tèdìng)分析物之間的反應(yīng)產(chǎn)生的一些物理化學(xué)信號的變化，將其轉(zhuǎn)化后記錄下來。檢測靈敏度和準(zhǔn)確度有了很大的改善，自動化程度和現(xiàn)場檢測能力等方面有了較高的提高，檢測限可達(dá)20ppb。共一百三十五頁酶抑制(yìzhì)法---檢測方法酶抑制(yìzhì)法的影響因素：1）乙酰膽堿酯酶的來源目前乙酰膽堿酯酶主要來源于動物肝臟、血液以及昆蟲。2）乙酰膽堿酯酶的純化高純度的乙酰膽堿酯酶可大大提高分析的靈敏度。3）酶的穩(wěn)定性在不同批次上，酶的活性存在差異，使分析結(jié)果有所不同。共一百三十五頁酶抑制法---檢測(jiǎncè)方法4）酶反應(yīng)溫度溫度影響結(jié)果是相當(dāng)嚴(yán)重的，造成個體操作實驗結(jié)果表現(xiàn)出較大的差異。5）檢測樣本的影響一些含有辛辣物質(zhì)的蔬菜如：蘿卜(luóbo)、韭菜、茭白和蘑菇等，往往產(chǎn)生假陽性。共一百三十五頁農(nóng)藥(nóngyào)殘留分析舉例1、肉制品中六六六殘留分析1）提取

稱取試樣10g,置于具塞三角瓶中,加入1:1高氯酸-冰乙酸混合液50ml并靜置5min,然后置于80℃水浴上,并不時振搖25min左右,取下冷卻至室溫。將消化液轉(zhuǎn)移至250ml分液漏斗中,并以25ml水洗滌(xǐdí)三角瓶,洗液并入分液漏斗。以30、20、20、20、10ml石油醚(或正己烷)分五次從消化液中提取農(nóng)藥。合并石油醚(或正己烷)提取液。共一百三十五頁農(nóng)藥殘留分析(fēnxī)舉例2)凈化

向上述提取液中加入濃硫酸10ml(提取液與濃硫酸體積比為10:1)；輕輕振搖1～2次,靜置分層,棄去下層(xiàcéng)溶液。重復(fù)凈化2～3次至下層(xiàcéng)溶液近無色,加入2％硫酸鈉溶液100ml,振搖后靜置分層,棄去下層(xiàcéng)水溶液,用濾紙吸除分液漏斗頸內(nèi)外的水。然后將石油醚經(jīng)盛有約15g無水硫酸鈉的漏斗,并以石油醚洗滌漏斗數(shù)次。共一百三十五頁農(nóng)藥(nóngyào)殘留分析舉例3)濃縮

合并濾液(lǜyè)和洗液,將全部溶液濃縮至1ml,供GC分析用。

共一百三十五頁農(nóng)藥殘留分析(fēnxī)舉例4）色譜條件

DB-130m×0.32mm×0.25um柱溫：220℃開始,升溫速率5℃/min,升至260℃，保持10min；載氣:高純氮氣,1.0ml/min。電子捕獲檢測器（ECD），溫度(wēndù)：280℃；進(jìn)樣口溫度:250℃。進(jìn)樣量:1ul，不分流進(jìn)樣。共一百三十五頁農(nóng)藥(nóngyào)殘留分析舉例

在上述色譜條件下,混標(biāo)各組分(zǔfèn)的出峰順序為：α-666、γ-666、β-666、δ-666、PP′-DDE、OP′-DDT、PP′-DDD和PP′-DDT。共一百三十五頁農(nóng)藥殘留分析舉例(jǔlì)-氣相色譜法測定六六六、DDT標(biāo)準(zhǔn)色譜圖共一百三十五頁有機氯農(nóng)藥(nóngyào)殘留量的檢驗是一大類含氯原子的有機殺蟲劑，有六六六、滴滴涕、狄氏劑、異狄氏劑、艾氏劑等。為脂溶性化合物，易溶于丙酮、乙醚等有機溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定。GC測定凈化時，可采用磺化法凈化，樣品提取液中的脂肪和其他一些雜質(zhì)可與濃硫酸作用引入磺酸基團(tuán)，分子極性增大，從石油醚中轉(zhuǎn)入硫酸溶液。有機氯農(nóng)藥(nóngyào)對硫酸穩(wěn)定。加水、丙酮振搖后再加石油醚振搖提取。共一百三十五頁有機磷農(nóng)藥(nóngyào)殘留量的檢驗是一大類含磷酸酯結(jié)構(gòu)的有機殺蟲劑。結(jié)構(gòu)見課本P111急性中毒，分解快。有機磷農(nóng)藥可以抑制膽堿酯酶的活性。不可逆。在堿性條件(tiáojiàn)下水解；硫代磷酸酯在一定條件(tiáojiàn)下可被氧化為普通的磷酸酯。用丙酮、水和二氯甲烷提取。共一百三十五頁氨基甲酸酯類農(nóng)藥(nóngyào)殘留量的檢驗含有氨基甲酸基本化學(xué)基團(tuán)。結(jié)構(gòu)見課本P114。毒性機理與有機磷類似，但抑制是可逆的。所以毒性較小。氨基甲酸酯為酯類化合物，堿性條件下分解生成甲胺和二氧化碳。芳基N-氨基甲酸酯農(nóng)藥(nóngyào)水解產(chǎn)物有酚類物質(zhì)，可以偶聯(lián)顯色。多數(shù)極性較大。丙酮、水振搖，二氯甲烷萃取。共一百三十五頁食品中擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留(cánliú)的檢驗是一類結(jié)構(gòu)或生物活性類似天然除蟲菊酯的仿生合成(héchéng)殺蟲劑。毒性最低。溶于各種有機溶劑，堿性條件下易分解。石油醚、丙酮提取。共一百三十五頁課后復(fù)習(xí)農(nóng)殘的定義、分類、特點及其分析步驟酶抑制法原理(yuánlǐ)有機氯農(nóng)藥的分類氨基甲酸酯毒性機理與有機磷類似，但抑制是可逆的。堿性條件下分解擬除蟲菊酯毒性最低共一百三十五頁共一百三十五頁共一百三十五頁課后復(fù)習(xí)農(nóng)殘的定義、分類、特點(tèdiǎn)及其分析步驟酶抑制法原理有機氯農(nóng)藥的分類氨基甲酸酯毒性機理與有機磷類似，但抑制是可逆的。堿性條件下分解擬除蟲菊酯毒性最低共一百三十五頁共一百三十五頁共一百三十五頁共一百三十五頁共一百三十五頁共一百三十五頁2010年2月19日開始出現(xiàn)的廣州市豬肉精中毒事件累計發(fā)病人數(shù)增加到70人2010年8月30日多地長江野生魚測出有害物質(zhì)環(huán)境激素”壬基酚和辛基酚，全氟辛烷磺酸(huánɡsuān)，部分魚體內(nèi)還檢測出了汞、鉛和鎘等重金屬。

2010年9月5日養(yǎng)殖大閘蟹被喂腐爛動物尸體和避孕藥

2010年11月25日

飼料抗生素2011年3月15日河南雙匯瘦肉精事件

共一百三十五頁共一百三十五頁共一百三十五頁第八章食品(shípǐn)中獸藥殘留檢驗8.1概述8.2食品(shípǐn)中抗生素類獸藥殘留檢驗8.3鹽酸克倫特羅殘留的檢驗8.4激素類獸藥殘留的檢驗共一百三十五頁第一節(jié)概述(ɡàishù)一、獸藥和獸藥殘留二、食品中獸藥殘留的來源三、獸藥殘留的危害(wēihài)四、獸藥殘留監(jiān)控五、獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)體系共一百三十五頁一、獸藥和獸藥殘留(cánliú)獸藥：獸藥（veterinarydrugs)是指用于預(yù)防、治療和診斷動物疾病或者有目的地調(diào)節(jié)動物生理機能并規(guī)定作用、用途、用法、用量的物質(zhì)（含藥物飼料添加劑）。獸藥殘留：(residueofveterinarydrugs）是指食品動物用藥后或長期(chángqī)喂養(yǎng)含藥物飼料后，動物性食品中含有的某種獸藥的原形或其代謝物以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)的殘留。（狹義）化學(xué)物(Chemicals)殘留：除獸藥外還包括通過食物鏈進(jìn)入動物體內(nèi)的農(nóng)藥（如殺蟲劑、除草劑等）和環(huán)境污染物(如重金屬、霉菌毒素等)。（廣義）共一百三十五頁共一百三十五頁二、食品中獸藥殘留(cánliú)的來源產(chǎn)生的途徑獸藥和添加劑的使用防治動物疫病使用藥物添加劑動物性食品保鮮使用違禁(wéijìn)獸藥環(huán)境污染物共一百三十五頁二、食品(shípǐn)中獸藥殘留的來源獸藥殘留產(chǎn)生的主要原因不遵守休藥期的規(guī)定標(biāo)簽外用藥:劑量、劑型、給藥途徑、療程、適應(yīng)癥、動物非法使用違禁藥物克倫特羅、己烯雌酚等污染(wūrǎn)飼料加工、貯藏、運輸共一百三十五頁三、獸藥殘留(cánliú)的危害（一）毒性作用急性中毒(zhòngdú)；慢性中毒(zhòngdú)；“三致”作用。急性毒性克倫特羅（瘦肉精）中毒慢性毒性氯霉素、氨基糖苷類、灰黃霉素等共一百三十五頁三、獸藥殘留(cánliú)的危害特殊毒性（“三致作用”）雌激素類（己烯雌酚）、同化激素（苯丙酸諾龍）喹惡啉類（卡巴氧）硝基呋喃(fūnán)類（呋喃(fūnán)西林、呋喃(fūnán)他酮）砷制劑苯并咪唑類殺蟲劑（666）氯羥吡啶、SM2等甲醛、苯酚等共一百三十五頁三、獸藥殘留(cánliú)的危害（二）耐藥性（三）過敏反應(yīng)（四）激素（樣）作用(zuòyòng)（五）污染環(huán)境影響生態(tài)共一百三十五頁耐藥菌庫食品(shípǐn)動物治療、預(yù)防(yùfáng)或促生長用抗菌藥人類動物性食品糞便耐藥病原菌耐藥正常腸道菌環(huán)境、水、植物耐藥菌殘留的抗菌藥病原菌耐藥增強正常腸道菌耐藥增強耐藥基因土壤、水生環(huán)境中的細(xì)菌耐藥性增加共一百三十五頁獸藥使用不當(dāng)、飼料中過量添加抗生素及生長促進(jìn)素對食品安全性的影響，逐漸突出起來，一些研究趨向于認(rèn)為，最近動物性食品中的某些致病菌如沙門氏菌和大腸桿菌O-157，可能是在濫用抗生素條件下抗性提高了的新的致病菌系。現(xiàn)在把抗生素作為飼料添加劑雖有顯著的增產(chǎn)防病作用，但除了抗生素本身在使用不當(dāng)時(dàngshí)可產(chǎn)生有害副作用外，也導(dǎo)致了這些抗生素對人的醫(yī)用效果逐漸喪失。共一百三十五頁四、獸藥殘留監(jiān)控(jiānkònɡ)

五、獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)體系（一）獸藥最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（二）食品中獸藥殘留的檢驗方法(fāngfǎ)GC、HPLC、ELISA和儀器聯(lián)用共一百三十五頁（三）獸藥殘留(cánliú)分析技術(shù)概述獸藥殘留分析技術(shù)的特點待測物質(zhì)濃度低樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多獸藥殘留代謝產(chǎn)物多樣或不明動物種類多樣，對藥物(yàowù)代謝存在差異共一百三十五頁（四）獸藥殘留(cánliú)分析與監(jiān)測殘留分析的樣品樣品的前處理(chǔlǐ)殘留檢測方法采樣與樣品制備（樣品預(yù)處理）提取凈化濃縮衍生化分辨檢測樣品處理測定分離殘留分析原理共一百三十五頁色譜分析(sèpǔfēnxī)技術(shù)超高效(ɡāoxiào)液相色譜系統(tǒng)(UltraPeerformanceLC)共一百三十五頁高效毛細(xì)管電泳(diànyǒnɡ)色譜系統(tǒng)(HighPerformanceCapillaryElectrophoresisSystems，HPCE)共一百三十五頁高精密度串聯(lián)(chuànlián)質(zhì)譜——GC/MS/MS、HPLC/MS/MS共一百三十五頁1pg/g1ng/g1

g/g1mg/g紫外/可見分光光度法放射免疫測定法/酶免疫測定法色質(zhì)聯(lián)用分析放射受體分析氣相色譜(ECD/NPD)氣相色譜(FID)高效液相色譜(FLD/UVD)極譜法熒光分光光度法微生物測定法比色法各種(ɡèzhǒnɡ)測定方法的靈敏度范圍共一百三十五頁第二節(jié)食品中抗生素類獸藥殘留(cánliú)的檢驗抗藥性機制：1.使抗生素分解或失去活性2.使抗菌藥物作用的靶點發(fā)生改變(gǎibiàn)

3.細(xì)胞特性的改變4.細(xì)菌產(chǎn)生藥泵將進(jìn)入細(xì)胞的抗生素泵出細(xì)胞5.改變代謝途徑

共一百三十五頁第二節(jié)食品中抗生素類獸藥殘留(cánliú)的檢驗四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類藥物類一、四環(huán)素類抗生素的殘留檢驗四環(huán)素類抗生素（tetracyclines,簡稱TCs）是家畜(jiāchù)、家禽常用的防病治病藥物。主要有四環(huán)素（tetracyclines,TC）、土霉素（oxytetracycline，OTC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）。共一百三十五頁第二節(jié)食品中抗生素類獸藥殘留(cánliú)的檢驗（一）概述四環(huán)素類抗生素具有(jùyǒu)十二氫化并四苯基本結(jié)構(gòu)。酸堿兩性化合物。共一百三十五頁（二）HPLC法測定四環(huán)素類獸藥殘留(cánliú)原理：樣品提取后，微孔濾膜過濾后，上清液用HLB固相萃取柱凈化，直接(zhíjiē)進(jìn)樣，用反相色譜分離，紫外檢測器檢測。標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。樣品處理：取一定量切碎的肉樣食品，用適量5％高氯酸振蕩提取，將提取液離心后取上清液經(jīng)濾膜過濾。共一百三十五頁在流動相中加入磷酸二氫鈉并調(diào)節(jié)pH為2.5，可以改善分離度和峰形。用5％高氯酸處理樣品時，當(dāng)pH值低于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)以陽離子形式存在，高氯酸可與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性鹽而沉淀，通過(tōngguò)離心除去。共一百三十五頁二、氯霉素類抗生素的殘留(cánliú)檢驗氯霉素類（chloramphenicols，CAPs）獸藥包括(bāokuò)氯霉素（chloramphenicol，CAP）、無味氯霉素（chlo-ramphenicolpalmitate，CRP）、乙酰氯霉素（cetofenicol，CF）、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）、氟甲砜霉素（florfenicol，F(xiàn)F）等。共一百三十五頁（一）概述(ɡàishù)理化性質(zhì)：氯霉素類抗生素是1-苯基-2-氨基-1-丙醇的二乙酰胺的衍生物。毒性：CAPs對骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞有毒性作用，可導(dǎo)致(dǎozhì)氯霉素敏感者的再生障礙性貧血。CAPs是禁止用于食品動物并不得在動物性食品中檢出的抗生素。共一百三十五頁（二）CAP獸藥殘留(cánliú)的檢驗1.氣相色譜法原理：樣品經(jīng)提取、凈化和衍生化后，用毛細(xì)管氣相色譜柱分離，ECD檢測(jiǎncè)器檢測(jiǎncè)。樣品處理：取適量樣品加乙腈提取、離心，提取液過SPEC18柱凈化后，凈化液用N,O-二（三甲基硅）三氯醋酸銨＋三甲基氯硅烷（99＋1）試劑進(jìn)行衍生化處理。共一百三十五頁2.液相色譜(sèpǔ)-串聯(lián)質(zhì)譜法原理：樣品用乙酸乙酯提取，濃縮后用水溶解，固相萃取柱凈化，液-質(zhì)聯(lián)用測定。樣品處理：提取，稱取試樣(shìyànɡ)加水溶解，準(zhǔn)確加入乙酸乙酯振蕩提取，離心后準(zhǔn)確吸取上層乙酸乙酯在55℃減壓濃縮至干，加水溶解殘渣；凈化，將提取液轉(zhuǎn)入固相萃取硅膠小柱中，用乙腈＋水（1＋7）淋洗。用乙酸乙酯洗脫，將洗脫液于50℃用氮氣吹干，用乙腈＋水（20＋80）定容，供測定。共一百三十五頁三、磺胺類獸藥殘留(cánliú)檢驗理化性質(zhì)：磺胺類藥物（sulfonamides，SAs）是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱。常見(chánɡjiàn)的有磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶等。均為白色結(jié)晶性粉末，不溶于水，微溶于乙醇、丙酮，可溶于稀鹽酸、氫氧化鈉或氨溶液中。共一百三十五頁磺胺類藥物(yàowù)的分子結(jié)構(gòu)

共一百三十五頁食品(shípǐn)中磺胺類藥物的最高殘留限量英、美等國家對磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為100μg·kg-1；歐盟第675/92號令中規(guī)定，在肉類及牛奶中磺胺的最大殘留總量不得超過(chāoguò)100μg·kg-1；日本要求的最高殘留限量更嚴(yán)格，單個磺胺殘留限量為20μg·kg-1，最大殘留總量不得超過100μg·kg-1；我國對磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為100μg·kg-1。共一百三十五頁HPLC法測定磺胺類獸藥殘留(cánliú)原理：動物性食品樣品用乙腈或（乙酸乙酯+0.1mol/l鹽酸）提取后，加正己烷萃取除去脂溶性雜質(zhì)，再加入正丙醇，減壓干燥，殘留物用乙腈溶解，過MCX固相萃取柱除去雜質(zhì)，再加正丙醇，減壓干燥后的殘留物用流動相溶解，樣液用液相紫外檢測器檢測?；前奉愃幬锞哂袑Π被交酋０方Y(jié)構(gòu)，極性較大(jiàodà)，95％乙腈的極性較小，洗脫能力相對較弱，僅能洗脫雜質(zhì)，而70％的乙腈極性較大(jiàodà)，洗脫能力較強，能將氧化鋁中的磺胺類藥物洗脫出來。共一百三十五頁第三節(jié)硝基呋喃(fūnán)類獸藥殘留檢驗（一）概述硝基呋喃類藥物包括(bāokuò)呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。為黃色粉末或結(jié)晶粉末，能溶于二甲基甲酰胺。毒性：可使實驗動物癌變和基因突變，CAC、中國和歐美等國家禁止使用此類獸藥。分析方法：ELISA、HPLC、LC-MS等。共一百三十五頁（二）HPLC法測定畜禽肉中呋喃唑酮原理：畜禽肉樣與C18填料充分研磨均勻后裝入層析柱，用正己烷沖洗，真空抽干后用乙酸乙酯洗脫，洗脫液減壓濃縮至干，流動(liúdòng)相溶解過氧化鋁柱后進(jìn)樣。樣品處理：稱取適量肉樣，按1：1.5比例加入C18，混勻后裝入層析柱，用正己烷沖洗，去除脂肪，真空抽干后用乙酸乙酯洗脫，洗脫液50-55℃下減壓濃縮至干，流動相溶解過氧化鋁柱凈化后進(jìn)樣。共一百三十五頁（三）畜禽肉中呋喃唑酮殘留(cánliú)表示物測定原理(yuánlǐ)：樣品中加入苯甲醛，與其中呋喃唑酮殘留的表示物3-氨基-2-噁唑烷酮衍生化，衍生物提取后與結(jié)合在酶標(biāo)板上的抗原共同競爭抗體，再與酶標(biāo)形成的酶標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物與顯色劑反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定吸光度值，計算樣品中3-氨基-2-噁唑烷酮（AOZ）的含量。共一百三十五頁第四節(jié)β受體激動劑類獸藥殘留(cánliú)的檢驗一、概述理化性質(zhì)：β受體激動劑類藥物具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核結(jié)構(gòu)。分為苯胺型和苯酚型；鹽酸克倫特羅商品名稱由克瑞素、息喘寧等，俗名瘦肉精。白色或白色結(jié)晶粉末(fěnmò)，溶于水、乙醇。化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。毒性：是選擇性β2-腎上腺激素受體激動劑。具有調(diào)節(jié)動物神經(jīng)興奮功能。長期食用可導(dǎo)致染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤等。共一百三十五頁二鹽酸(yánsuān)克倫特羅殘留的檢驗（一）GC-MS測定法原理：將肉類樣品剪碎用高氯酸勻漿(yúnjiānɡ)，超聲波提取，再用異丙醇-乙酸乙酯（40＋60）萃取，濃縮后經(jīng)弱陽離子交換柱進(jìn)行分離，用乙醇＋濃氨水（98＋2）洗脫，洗脫液濃縮，經(jīng)N，O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺衍生后用GC-MS測定。共一百三十五頁提取：取適量肉樣加0.1mol/L高氯酸勻漿，超聲波提取后80℃水浴，冷卻離心取上清液，加入異丙醇-乙酸乙酯（40＋60）萃取，將上層有機相60℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用0.1mol/LNaH2PO4緩沖液溶解。凈化：提取液過陽離子交換柱，用水、乙醇洗去雜質(zhì)，用乙醇＋濃氨水(ānshuǐ)（98＋2）洗脫，洗脫液濃縮。衍生化：凈化后殘渣加入甲醇和內(nèi)標(biāo)，濃縮至干迅速加入BSTFA，密閉75℃衍生化。蒸干后加甲苯待測。樣品(yàngpǐn)處理共一百三十五頁（二）HPLC測定法原理：將肉類樣品剪碎用5％高氯酸勻漿，超聲波提取，再用異丙醇-乙酸乙酯（40＋60）萃取，有機相濃縮(nónɡsuō)后經(jīng)弱陽離子交換柱進(jìn)行分離，用乙醇＋濃氨水（98＋2）洗脫，洗脫液濃縮(nónɡsuō)，流動相定容后在HPLC儀上進(jìn)行測定。共一百三十五頁（三）酶聯(lián)免疫吸附法原理：將已知抗原(kàngyuán)吸附在酶標(biāo)微孔板表面，洗除未吸附抗原