DB21-T 3879-2023 動物弓形蟲病熒光免疫層析試紙條檢測技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.30CCSB4121Inspectionspecificationforfluorescentimmunochromatographicdectectionof2023-11-30發(fā)布DB21/T3879—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)、遼寧偉嘉農(nóng)牧生態(tài)食品有限公司。本文件主要起草人：楊娜、桑曉宇、馮穎、劉攀峰、鄧亮、陳冉、楊作豐、李紅魁、范治斌、薛英、李德臣、李佳祺、王英。本文件發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復(fù)并認真處理，根據(jù)實際情況依法進行評估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)（沈陽市沈河區(qū)東陵路120號聯(lián)系電話1DB21/T3879—2023動物弓形蟲病熒光免疫層析檢測技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了動物弓形蟲病熒光免疫層析檢測技術(shù)規(guī)程，包括規(guī)范性引用文件、原則、儀器與試劑、樣品采集與處理、檢測、結(jié)果計算、判定標準。本文件適用于動物（豬、貓等）血清中弓形蟲抗體水平的快速檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原則基于雙抗原夾心熒光免疫層析法，將待檢血清樣品加入弓形蟲熒光免疫層析試紙卡樣品墊上，通過虹吸作用沿層析條側(cè)向流動，在檢測區(qū)被檢測，如果是陽性，則T線（注：T線為檢測線）出現(xiàn)條帶；如果是陰性，則T線無條帶；另外，如果C線（注：C線為質(zhì)控線）出現(xiàn)說明試紙條是有效的，否則無效。將試紙卡放入熒光免疫分析儀中，通過測定熒光信號強度，可以對抗體滴度進行定量分析。5儀器與試劑5.1儀器5.1.1熒光免疫分析儀激發(fā)波長為365nm±5nm，檢測波長為610nm±5nm。5.1.2單道可調(diào)移液器2DB21/T3879—20235.1.3分析天平最小分度值為0.001g。5.1.4離心機離心速度3000rpm/min。5.1.5冰箱2℃~8℃,-20℃。5.2試劑5.2.1樣品稀釋液見附錄A。5.2.2弓形蟲熒光免疫層析試紙卡熒光微球標記的弓形蟲重組抗原和雞IgY埋置在標記物墊內(nèi)；硝酸纖維素膜（NC膜）的測試線（T線）和控制線（C線）分別包被弓形蟲重組抗原和羊抗雞IgY的IgG（備注：熒光微球標記墊里需要另外標記一種與弓形蟲抗原無關(guān)的抗原物質(zhì)，在此選用雞的IgY，因此在硝酸纖維素膜上的控制線位置就標記上抗雞IgY的抗體IgG，IgY與IgG結(jié)合反應(yīng)，C線就出現(xiàn)條帶，說明試紙條是合格的）。（見圖1）圖1熒光免疫層析試紙卡結(jié)構(gòu)①樣品墊；②PVC底板；③待檢血清樣品；④標記物墊；⑤測試線（T線⑥控制線（C線⑦NC膜（硝酸纖維素膜⑧吸水濾紙6樣品采集與處理DB21/T3879—20236.1樣品的采集按照NY/T541中的規(guī)定進行，并做好安全防護。按常規(guī)方法用干燥、潔凈的無抗凝劑的離心管或適當容器采集3mL～5mL的血液。6.2樣品的處理血液樣本用離心機3000rpm/min離心3min～5min，分離血清，血清量不少于500μL。6.3樣品的貯存血清樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)小于24h。如需長期保存應(yīng)置于－20℃條件下，避免反復(fù)凍融。7檢測7.1樣本稀釋將弓形蟲熒光免疫層析試紙和待檢血清樣品回溫至25℃左右。將待檢血清樣本先用樣品稀釋液進行3倍稀釋，即1份待檢血清樣品與2份樣品稀釋液混合（例如，75μL待檢血清樣品與150μL樣品稀釋液混合）。7.2加樣將熒光免疫層析檢測卡放于干凈平坦的臺面上，用移液器吸取已經(jīng)稀釋好的75μL待檢血清樣本，垂直加樣于檢測卡的加樣孔內(nèi)。7.3熒光檢測室溫靜置15min，立即采用熒光免疫分析儀檢測，測定T線和C線熒光信號，讀取分析儀顯示數(shù)值，該數(shù)值即為抗體效價。7.4有效性控制7.4.1空白對照將熒光免疫層析檢測卡放于干凈平坦的臺面上，用移液器吸取樣品稀釋液75μL于檢測卡的加樣孔內(nèi)，如果控制線（C線）檢測到熒光信號，試驗結(jié)果有效；否則，試驗無效。7.4.2陰性對照4DB21/T3879—2023將熒光免疫層析檢測卡放于干凈平坦的臺面上，用移液器吸取稀釋液稀釋好的陰性血清75μL于檢測卡的加樣孔內(nèi)，如果控制線（C線）檢測到熒光信號，試驗結(jié)果有效；否則，試驗無效。7.4.3陽性對照將熒光免疫層析檢測卡放于干凈平坦的臺面上，用移液器吸取稀釋液稀釋好的陽性血清75μL于檢測卡的加樣孔內(nèi)，如果控制線（C線）和檢測線（T線）檢測到熒光信號，試驗結(jié)果有效；否則，試驗無效。8結(jié)果計算An（n=1,2,3,4,5）-熒光免疫分析儀讀取標準品溶液的檢測卡上的熒光信號的T/C值。以標準品溶液的T/C值的對數(shù)為縱坐標，以弓形蟲抗體陽性血清效價的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將待測樣本的熒光信號的T/C值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出所對應(yīng)的樣本的弓形蟲抗體效價。注：軟件自帶計算功能，能準確算出當前樣本熒光信號的T/C值所對應(yīng)的弓形蟲抗體效價。9判定標準被檢血清抗體效價≥1:128時，判為陽性；被檢血清抗體效價≤1:64時，判為陰性；被檢血清抗體效價1:64～1:128時，判為可疑。DB21/T3879—2023（資料性）樣品稀釋液A.1樣品稀釋液成分Na2HPO42O4.02gNaH2PO42O0.66gNaCl9gProclin3001mL吐溫20（Tween-20）1mL雙蒸水1LA.2