低直鏈淀粉基因的遺傳分析與基因定位

序號(hào)：編碼：第十一屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽作品申報(bào)書作品名稱：XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位學(xué)校全稱：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)申報(bào)者姓名（集體名稱）：胡小梅鄧杏陳月柳彭景芳趙娟類別：■自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 □哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類

說(shuō)明1．申報(bào)者應(yīng)在認(rèn)真閱讀此說(shuō)明各項(xiàng)內(nèi)容后按要求詳細(xì)填寫。2．申報(bào)者在填寫申報(bào)作品情況時(shí)只需根據(jù)個(gè)人項(xiàng)目或集體項(xiàng)目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報(bào)者可根據(jù)情況填寫C表。3．表內(nèi)項(xiàng)目填寫時(shí)一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報(bào)書可復(fù)制。4．序號(hào)、編碼由第十一屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽組委會(huì)填寫。5．學(xué)術(shù)論文、社會(huì)調(diào)查報(bào)告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請(qǐng)附中文本），請(qǐng)以4號(hào)楷體打印在A4紙上（文章版面尺寸14.5×22cm），附于申報(bào)書后，論文不超8000字，調(diào)查報(bào)告不超15000字。6．作品申報(bào)書須按要求由各校競(jìng)賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)統(tǒng)一寄送。7．其他參賽事宜請(qǐng)向本校競(jìng)賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)咨詢。A2申報(bào)者情況（集體項(xiàng)目）說(shuō)明：1．必須由申報(bào)者本人按要求填寫，申報(bào)者情況欄內(nèi)必須填寫個(gè)人作品的第一作者（承擔(dān)申報(bào)作品60%以上的工作者）；2．本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為對(duì)申報(bào)者情況的確認(rèn)。。申報(bào)者代表情況姓名胡小梅性別女出生年月1990年9月學(xué)院農(nóng)學(xué)院系別、專業(yè)、年級(jí)08農(nóng)業(yè)生物技術(shù)2班學(xué)歷在讀本科學(xué)制4入學(xué)時(shí)間2008年9月作品名稱XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位畢業(yè)論文題目無(wú)通訊地址廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林南區(qū)39棟郵政編碼510642辦公電話常住地通訊地址廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林南區(qū)39棟郵政編碼510642住宅電話其他作者情況姓名性別年齡學(xué)歷所在單位陳月柳女21在讀本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院彭景芳女21在讀本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院趙娟女21在讀本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院鄧杏女21在讀本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院資格認(rèn)定學(xué)院學(xué)籍管理部門意見(jiàn)以上作者是否為2011年7月1日前□是□否（部門簽章）年月日院系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖?jiàn)本作品是否為課外學(xué)術(shù)科技或社會(huì)實(shí)踐活動(dòng)成果□是□否負(fù)責(zé)人簽名：年月日

B1．申報(bào)作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說(shuō)明：1．必須由申報(bào)者本人按要求填寫；2．申報(bào)者代表必須是作者中學(xué)歷最高者，其余作者按學(xué)歷高低排列；3．本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為申報(bào)者情況的確認(rèn)。作品全稱XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位（學(xué)術(shù)論文）作品分類（D）A．機(jī)械與控制（包括機(jī)械、儀器儀表、自動(dòng)化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計(jì)算機(jī)、電信、通訊、電子等）C．?dāng)?shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等）D．生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路水稻是我國(guó)最重要的糧食作物，直鏈淀粉含量過(guò)高已成為制約南方早秈和雜交稻品質(zhì)改良的關(guān)鍵因素之一，目前單一的Wx復(fù)等位基因已無(wú)法滿足秈稻品質(zhì)改良需求，因此，發(fā)掘和創(chuàng)造秈型非Wx低直鏈淀粉水稻突變體，明確其遺傳機(jī)理和基因功能，具有重要的理論和實(shí)踐意義。前期研究表明，秈稻突變體XLA-1低直鏈淀粉性狀由非Wx低直鏈淀粉突變基因控制。本項(xiàng)目在前期研究基礎(chǔ)上,利用特異性功能引物鑒定XLA-1含有的突變基因與野生型Wx基因差異；運(yùn)用遺傳學(xué)手段明確XLA-1低直鏈淀粉突變基因與Wx基因的互作關(guān)系，闡明其遺傳機(jī)理；利用分子生物學(xué)手段定位XLA-1低直鏈淀粉突變基因，并獲得與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，為水稻品質(zhì)改良提供理論依據(jù)和種質(zhì)材料。作品的科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處科學(xué)性：Wx基因編碼的顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS）是直鏈淀粉合成的關(guān)鍵酶，其具有一系列復(fù)等位基因，從而影響直鏈淀粉含量高低，是目前生產(chǎn)上利用的最主要的基因資源。在育種實(shí)踐上，由于直鏈淀粉性狀屬于三倍體遺傳，因此利用Wx復(fù)等位基因改良水稻直鏈淀粉含量難度較大。如在高AAC與低AAC的雜交后代中能出現(xiàn)中等AAC的個(gè)體，但這種個(gè)體的基因型是雜合的，后代還會(huì)出現(xiàn)繼續(xù)分離[9]，最終產(chǎn)生的是與親本AAC相似的純合體，育種選擇周期長(zhǎng)、效果差。如果利用非Wx低直鏈淀粉基因資源，由于遺傳重組的存在，在雜交后代中可以較快得到中等直鏈淀粉含量的純合體。先進(jìn)性：本實(shí)驗(yàn)室利用空間誘變技術(shù)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期觀察篩選，已經(jīng)得到多個(gè)秈型低直鏈淀粉含量突變體，這些突變體的獲得為深入闡明水稻直鏈淀粉調(diào)控機(jī)理奠定了材料基礎(chǔ)。本項(xiàng)目通過(guò)突變體精細(xì)定位分離克隆控制水稻低直鏈淀粉相關(guān)基因或QTL，并獲得與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，項(xiàng)目研究成果不僅能為優(yōu)質(zhì)水稻分子育種技術(shù)平臺(tái)提供有利的品質(zhì)基因資源，而且可為深入理解秈稻直鏈淀粉調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。獨(dú)特之處：本研究所用材料為秈型非Wx低直鏈淀粉調(diào)控基因，目前國(guó)內(nèi)有關(guān)秈稻低直鏈淀粉研究報(bào)道較少。本研究不僅材料上具有創(chuàng)新性，而且對(duì)揭示秈稻直鏈淀粉性狀的調(diào)控及分子機(jī)理具有較大的理論意義。作品的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義水稻是禾本科作物基因組研究的模式植物，目前在水稻中已經(jīng)報(bào)道的淀粉合成相關(guān)基因有20多個(gè),但這些基因如何相互作用調(diào)控淀粉的含量與結(jié)構(gòu)尚未明確發(fā)現(xiàn)，因此，非Wx低直鏈淀粉基因的精細(xì)定位和克隆對(duì)研究禾本科作物的淀粉合成機(jī)理和品質(zhì)育種具有重要的意義?？筛鶕?jù)此結(jié)果育出穩(wěn)定遺傳的直鏈淀粉含量低的水稻品種，若用于生產(chǎn)則大大地解決了人們對(duì)于米飯口感品質(zhì)的要求。也可將此基因克隆轉(zhuǎn)入其他品種來(lái)改善其品質(zhì)或者利用常規(guī)育種將此基因順利導(dǎo)入其它高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻種育出更好的品種。學(xué)術(shù)論文文摘摘要：在前期研究基礎(chǔ)上，本研究以低直鏈淀粉突變體XLA-1為材料，利用SSR標(biāo)記與作圖群體，在第6染色體上端定位了一個(gè)非Wx基因lac（暫命名），該基因位于SSR標(biāo)記RM19288、RM19297之間，遺傳距離分別為5.05cM和4.1cM，且位于Wx基因的上端。通過(guò)與已定位的低直鏈淀粉突變基因位置比對(duì)，初步表明lac為一新的秈稻低直鏈淀粉含量基因。通過(guò)該基因的獲得，豐富了秈稻的低直鏈淀粉基因資源，也為該基因的精細(xì)定位和圖位克隆研究打下了良好的基礎(chǔ)作品在何時(shí)、何地、何種機(jī)構(gòu)舉行的會(huì)議上或報(bào)刊上發(fā)表及所獲獎(jiǎng)勵(lì)獲2011年華南農(nóng)業(yè)大學(xué)“丁穎杯”課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽二等獎(jiǎng)鑒定結(jié)果（1）明確XLA-1低直鏈淀粉突變特性遺傳機(jī)理；（2）將秈型非Wx低直鏈淀粉突變基因lac定位于兩個(gè)分子標(biāo)記間，遺傳距離均小于5cM。請(qǐng)?zhí)峁?duì)于理解、審查、評(píng)價(jià)所申報(bào)作品具有參考價(jià)值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻(xiàn)的檢索目錄[1]胡培松,翟虎渠,萬(wàn)建民,等.中國(guó)水稻生產(chǎn)新特點(diǎn)與稻米品質(zhì)改良.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2002,4(4):33-39.[2]I.Mikami,N.Uwatoko,Y.Ikeda,etal.AllelicdiversificationatthewxlocusinlandracesofAsianrice.TheorApplGenet,2008,116:979-989.[3]何鳳華,曾瑞珍,席章?tīng)I(yíng),等.不同Wax基因型水稻的遺傳多樣性.分子植物育種,2003,1(2):179-186.[4]舒慶堯,吳殿星,夏英武,等.秈稻和粳稻中蠟質(zhì)基因座位上微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性及其與表觀直鏈淀粉含量的關(guān)系.遺傳學(xué)報(bào),1999，26(4)：350-358.[5]張建勇，陳德全李仕貴，馬玉清，等。利用分子標(biāo)記鑒定水稻品種的Wx等位基因及其與直鏈淀粉含量的關(guān)系作物學(xué)報(bào)2005，04[6]包勁松舒慶堯吳殿星等水稻W(wǎng)x基因（CT）n微衛(wèi)星標(biāo)記與稻米淀粉品質(zhì)的關(guān)系研究農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)2000.8（3）241-244申報(bào)材料清單（申報(bào)論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）申報(bào)論文一篇《XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位》申報(bào)書一份科研管理部門簽章年月日

C.當(dāng)前國(guó)內(nèi)外同類課題研究水平概述說(shuō)明：1.申報(bào)者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評(píng)審。直鏈淀粉含量在5%-15%之間的低直鏈淀粉水稻，是介于一般粘米和糯米之間的中間類型，具有食味好、冷不回生、膨化性好等特點(diǎn)，是改良稻米直鏈淀粉含量和食味品質(zhì)的理想材料。目前已經(jīng)報(bào)道了20多種低直鏈淀粉突變體,其直鏈淀粉均低于15%，胚乳外觀表型多為半透明或不透明，少數(shù)為透明的[1]。日本、韓國(guó)等東亞國(guó)家偏食軟性粳米，故對(duì)低直鏈淀粉含量水稻育種非常重視。日本自20世紀(jì)80年代中期開(kāi)始進(jìn)行低直鏈淀粉突變體誘變篩選和育種計(jì)劃，相繼育成MilkyQueen、Sari等一系列優(yōu)質(zhì)低直鏈淀粉含量品種，深受商家和消費(fèi)者歡迎。MilkyQueen是日本在1991年育成的低直鏈淀粉水稻品種，它是用N－甲基－N－亞硝基脲（MNU）處理“越光”的受精卵，獲得的低直鏈淀粉含量突變體,其直鏈淀粉含量為9%-12%。我國(guó)對(duì)低直鏈淀粉含量水稻品種選育的重視程度相當(dāng)不夠。我國(guó)云南地區(qū)特有的軟米品種,是野生稻中自然發(fā)生的低直鏈淀粉含量突變體，直鏈淀粉含量在8%-15%之間[2]。目前我國(guó)發(fā)現(xiàn)的低直鏈淀粉突變體大多數(shù)為粳稻類型，有關(guān)秈稻類型的低直鏈淀粉突變體報(bào)道較少。根據(jù)與Wx基因等位性關(guān)系的不同，可將目前已報(bào)道的低直鏈淀粉含量突變體分為與Wx等位和非等位兩大類。其中Wx-mq，Wxop等屬于與Wx等位的低直鏈淀粉含量基因，而du,lam(t)等屬于與Wx非等位的基因。Wx-mq發(fā)現(xiàn)于日本培育的低直鏈淀粉栽培品種MilkyQueen中,經(jīng)研究控制MilkyQueen的低直鏈淀粉含量的基因是1個(gè)Wx的等位基因,并命名為Wx-mq[3]，Wx-mq基因已被克隆。在尼泊爾水稻品種中發(fā)現(xiàn)的不透明胚乳自然突變體,籽粒外觀與糯稻相似,直鏈淀粉含量在10%左右,研究發(fā)現(xiàn)其低直鏈淀粉含量由1個(gè)隱性單基因控制,與Wx基因等位,將其命名為Wxop[5]。du基因是獨(dú)立于Wx的隱性單基因，該類型突變基因表型胚乳均為半透明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)8個(gè)du基因,分別命名為du-1，du-2，du-3,du-4，du-5，du(EM47)，du(2120)和du(2035)，其中du(2035)，du(EM47)位于第6染色體，du-4du-1du(2120)分別位于第4,7,9染色體上[6-8]。lam(t)基因來(lái)源于北海道品種Shiokari，該基因?yàn)榕cWx不等位的隱性單基因，位于第9染色體[4]。我國(guó)云南軟米品種毫屁、毫皮、毫木細(xì)和毫安悶的低直鏈淀粉性狀均由Wx復(fù)等位基因Wxhp控制[9]。目前du-1基因已被克隆[10]，尚未見(jiàn)到其它與Wx非等位低直鏈淀粉基因的克隆報(bào)道。對(duì)于水稻直鏈淀粉含量變化的分子機(jī)理，目前的研究主要集中于Wx復(fù)等位基因，有關(guān)非Wx低直鏈淀粉基因的調(diào)控機(jī)理研究較少。水稻中主要存在Wxa和Wxb兩種等位基因[11]，Wxa等位基因廣泛存在于秈稻，而Wxb等位基因主要存在于粳稻中。已有研究表明Wxa和Wxb的蛋白積累量主要和第一內(nèi)含子的剪接效率有關(guān)[12]，Aryes等[13]設(shè)計(jì)了SNP標(biāo)記484/w2r用于分析直鏈淀粉含量變異。另外，該剪接位點(diǎn)上游存在一個(gè)(CT)n重復(fù)序列，序列重復(fù)次數(shù)與直鏈淀粉含量具有很高的相關(guān)性,秈稻品種(CT)n重復(fù)次數(shù)相對(duì)較少，粳稻相對(duì)較多，并根據(jù)此序列設(shè)計(jì)了特異性微衛(wèi)星引物484/485[14]。上述研究主要針對(duì)直鏈淀粉含量介于15-25%之間的常規(guī)水稻品種，但這些結(jié)果仍不能很好解釋直鏈淀粉含量水平的多樣性，尤其是低直鏈淀粉含量形成機(jī)制，郭濤等[15]的研究表明，秈型低直鏈淀粉突變體XLA-1,XLA-2（CT）n多態(tài)性與糯稻相同，但其直鏈淀粉含量明顯高于糯稻，說(shuō)明還存在其它直鏈淀粉調(diào)控機(jī)制。在有關(guān)低直鏈淀粉合成調(diào)控機(jī)理方面，Zeng等[9]通過(guò)圖位克隆的方法得到了Du-1基因的全長(zhǎng)序列，分析表明，du-1基因與其野生型在第一外顯子（+1742）處存在一個(gè)堿基替換（堿基G突變?yōu)锳），從而導(dǎo)致了氨基酸序列錯(cuò)義突變（絲氨酸突變?yōu)樘扉T冬氨酸），功能研究表明du-1可能是一個(gè)淀粉合成的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)影響Wxb基因前體mRNA的剪接效率而降低直鏈淀粉含量。Isshhiki等[16]的研究表明，du-1和du-2不能形成類似于SR蛋白的剪接蛋白因子，使Wxb基因前體mRNA的正確剪接過(guò)程受到一定影響，從而導(dǎo)致直鏈淀粉含量降低。Sato等[17]克隆了Wx-mq全長(zhǎng)cDNA，與野生型Wxb基因相比，在編碼區(qū)發(fā)生了2個(gè)堿基的替換，497位的G變?yōu)锳，595位的T變?yōu)镃，從而使相應(yīng)的氨基酸序列產(chǎn)生了2個(gè)錯(cuò)義突變，推測(cè)這2個(gè)錯(cuò)義突變是造成直鏈淀粉含量下降的原因。馬曉東[9]的研究表明，四個(gè)云南軟米低直鏈淀粉基因均由Wx復(fù)等位基因Wxhp控制，該基因編碼區(qū)第四外顯子（+497個(gè)）處存在一個(gè)單堿基突變（堿基A突變?yōu)镚），編碼子由GAC突變?yōu)镚GC，導(dǎo)致了天門冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔瑔魏塑账嵬蛔兛赡軐?dǎo)致其空間構(gòu)象發(fā)生變化，不能充分結(jié)合在淀粉粒上催化直鏈淀粉的形成，從而導(dǎo)致直鏈淀粉含量降低。以上研究均來(lái)源于粳稻低直鏈淀粉突變體，由于秈型非Wx低直鏈淀粉突變基因的克隆尚未報(bào)道，因此秈稻低直鏈淀粉合成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上所述，低直鏈淀粉合成、加工和沉積途徑的分子機(jī)制目前仍尚未明晰，因此獲得各種類型的直鏈淀粉含量突變體（特別是秈型低直鏈淀粉突變體），通過(guò)各種方法克隆控制突變性狀的基因是解決上述問(wèn)題的一個(gè)有效措施，并可為稻米直鏈淀粉改良提供優(yōu)良的遺傳資源。本實(shí)驗(yàn)室利用空間誘變技術(shù)，已經(jīng)得到多個(gè)秈型低直鏈淀粉含量突變體[18]，這些突變體的獲得為深入闡明秈稻直鏈淀粉調(diào)控機(jī)理奠定了材料基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)[1]朱昌蘭，沈文飚,翟虎渠,等.水稻低直鏈淀粉含量基因育種利用的研究進(jìn)展.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2004，37(2):157-162.[2]曾亞文,申時(shí)全,楊忠義,等.云南稻種資源的蒸煮食味品質(zhì)研究.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,23(5):408-41[3]SatoH,SuzukiY,OkunoK,etal.Geneticanalysisoflow-amylosecontentinaricevariety'MilkyQueen'.JapanBreedingResearch,2001,3:13-19..[4]SatoH.Statusandperspectivesontheresearchesoflowamylosecontentrice.JapanAgricultureandHorticulture,2002,77(5):20-28.[5]MikamiI,AikawaM,HiranoHY,etal.Alteredtissue-specificexpressionattheWxgeneofopaquemutantsinrice.Euphytica,1999,105:91-97.[6]OkunoK,NagamineT,OkaM.Newlinesharboringdugenesforlowamylasecontentinendospermstarchofrice.JapanAgriculturalResearchQuarterly,1993,27:102-105.[7]YanoM,OkunoK,SatoH,etal.Chromosomallocationofgenesconditioninglowamylasecontentofendospermstarchesinrice(OryzasativaL.).TheoreticalandAppliedGenetics,1988,76:183-189.[8]KaushikPP,KhushGS.Geneticanalysisofendospermmutantsinrice,OryzasativaL.TheoreticalandAppliedGenetics,1991,83:146-152.[9]馬曉東.四個(gè)云南軟米水稻品種低直鏈淀粉含量形成機(jī)制研究.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007,p1.[10]DaliZeng,MeixianYan,YonghongWang,etal.Du1,encodinganovelPrp1protein,regulatesstarchbiosynthesisthroughaffectingthesplicingofWxbpre-mRNAsinrice(OryzasativaL.).PlantMolBiol,2007,65:501-509.[11]SanoY.Differentialregulationofwaxygeneexpressioninriceendosperm.TheorApplGenet，1984，68:467-473.[12]HiranoHY,SanoY.EnhancementofWxgeneexpressionandtheaccumulationofamylaseinresponsetocooltemperaturesduringseeddevelopmentinrice.Plantcellphysiol,1998,39(8):807-812.[13]AyresNM,McclungAM,LarkinPD,etal.Microsatellitesandasingle-nucleotidepolymorphismdifferentiateapparentamylaseclassesinanextendedpedigreeofUSricegermplasm.TheorApplGenet,1997,94:773-781.[14]BlighHF,TillRL,JONESCA.AmicrosatellitesequencecloselylinkedtothewaxygeneofOryzasativa.Euphytica,1995,86:83-85.[15]郭濤,韋璇,王慧,等.2個(gè)低直鏈淀粉含量秈稻突變體的遺傳分析.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,30(1):10-13.[16]IsshikiM,NakajimaM,SatoH,etal.Dull:ricemutantswithtissue-specificeffectsonthesplicingofthewaxypre-mRNA.ThePlantJournal,2000,23(4):451-460.[17]SatoH,SuzukiY,SakaiM,etal.MolecularcharacterizationofWx-mq,anovelmutantgeneforlowamylosecontentinendospermofrice(OryzasativaL.).BreedingScience,2002,52:131-135.[18]郭濤,蔡金洋,王慧,等.水稻空間誘變SP2代品質(zhì)性狀變異分析.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(1):6-9.D.推薦者情況及對(duì)作品的說(shuō)明說(shuō)明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報(bào)作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對(duì)推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓名陳志強(qiáng)性別男年齡46職稱教授（博導(dǎo)）工作單位國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技樓711室郵政編碼510642單位電話住宅電話推薦者所在單位簽章本實(shí)驗(yàn)課題組共同推薦該作品參與“挑戰(zhàn)杯”作品競(jìng)賽（簽章）年月日請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述胡小梅同學(xué)的參賽作品《XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位》是該同學(xué)承擔(dān)的科技創(chuàng)新計(jì)劃（已結(jié)題）項(xiàng)目研究?jī)?nèi)容之一。胡小梅同學(xué)及其組員在我“中心”實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了大量的品質(zhì)分析、分子生物學(xué)相關(guān)試驗(yàn)，方法科學(xué)、數(shù)據(jù)翔實(shí)可靠。請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)水稻是禾本科作物基因組研究的模式植物，目前在水稻中已經(jīng)報(bào)道的淀粉合成相關(guān)基因有20多個(gè),但這些基因如何相互作用調(diào)控淀粉的含量與結(jié)構(gòu)尚未明確發(fā)現(xiàn)，因此，非Wx低直鏈淀粉基因的精細(xì)定位和克隆對(duì)研究禾本科作物的淀粉合成機(jī)理和品質(zhì)育種具有重要的意義。該作品在秈稻中鑒定出一個(gè)非Wx直鏈淀粉調(diào)控因子，在理論及實(shí)踐上均具有較大意義。其它說(shuō)明推薦者情況姓名劉向東性別男年齡43職稱教授（博導(dǎo)）工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院818室郵政編碼510642單位電話住宅電話推薦者所在單位簽章（簽章）年月日請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述胡小梅同學(xué)及其組員在農(nóng)學(xué)院航天育種實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了參賽作品《XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位》的主體實(shí)驗(yàn)工作，實(shí)驗(yàn)中采用的遺傳分析和基因定位方法得當(dāng)，經(jīng)審閱其調(diào)查記錄，該作品數(shù)據(jù)真實(shí)、可靠，結(jié)果準(zhǔn)確。請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)作品通過(guò)分析低直鏈淀粉突變體與野生型Wx基因的多態(tài)性關(guān)系，對(duì)糯稻的低直鏈淀粉基因進(jìn)行了分子標(biāo)記和遺傳分析。作品選題具有意義，使用分析技術(shù)合適。試驗(yàn)結(jié)果豐富了水稻的低直鏈淀粉基因資源，對(duì)改良高直鏈淀粉材料的育種實(shí)踐具有一定的價(jià)值。其它說(shuō)明學(xué)校組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)確認(rèn)并蓋章（團(tuán)委代章）年月日校主管領(lǐng)導(dǎo)或校主管部門確認(rèn)蓋章年月日E．大賽組織委員會(huì)秘書處資格和形式審查意見(jiàn)組委會(huì)秘書處資格審查意見(jiàn)審查人（簽名）年月日組委會(huì)秘書處形式審查意見(jiàn)審查人（簽名）年月日組委會(huì)秘書處審查結(jié)果□合格□不合格負(fù)責(zé)人（簽名）年月日

F．參賽作品打印處XLA-1低直鏈淀粉基因的遺傳分析與分子定位胡小梅彭景芳趙娟陳月柳鄧杏摘要：在前期研究基礎(chǔ)上，本研究以低直鏈淀粉突變體XLA-1為材料，利用SSR標(biāo)記與作圖群體，在第6染色體上端定位了一個(gè)非Wx基因lac（暫命名），該基因位于SSR標(biāo)記RM19288、RM19297之間，遺傳距離分別為5.05cM和4.1cM，且位于Wx基因的上端。通過(guò)與已定位的低直鏈淀粉突變基因位置比對(duì)，初步表明lac為一新的秈稻低直鏈淀粉含量基因。通過(guò)該基因的獲得，豐富了秈稻的低直鏈淀粉基因資源，也為該基因的精細(xì)定位和圖位克隆研究打下了良好的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：XLA-1低直鏈淀粉基因遺傳分析分子定位Summary:BasedonthepublishedWxgenesequenceanalysis,apairofspecificprimer(484/485)wereusedtoamplifythefull-lengthsequenceofWxgenefromthemutant.SequencinganalysisshowedWxgenepolymorphismbetweenthelowamylosemutantandwild-type.Toexplainthegeneticmechanismofthemutantgene,themutantXLA-1hybridedseparatelywiththewild,highamyloseparents,glutinousrice.TheseparationofamylosetraitsinF1,F2,BCF1populationwereanalysed.ThelargepopulationsofF2generationwereobtainedbythehybridizationofXLA-1withmedium-andhighamyloseparents,respectively.ThegeneticdistancebetweenthemolecularmarkersandthemutantgenewerecalculatedfromF2generationoflowamyloseindividualplantsbyuseofthestealthgroupmethodandmolecularmarkerlinkageanalysisofthemutantgenes.Keywords：XLA-1contentsofamylasehiddengroupsmoleculargeneticmarkersgeneticanalysis水稻是我國(guó)第一大糧食作物，其總產(chǎn)量與播種面積列世界第一，二位【1】。近年來(lái)農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量不斷提高，人們對(duì)于大米的品質(zhì)的要求越來(lái)越高。而影響大米口感的一個(gè)重要因素就是水稻中直鏈淀粉含量，相對(duì)來(lái)說(shuō)，直鏈淀粉含量越低，食味品質(zhì)較好。研究表明除栽培條件對(duì)稻米中直鏈淀粉含量有影響外，直鏈淀粉在不同品種之間的含量差異是可遺傳的特性【2】，即水稻中直鏈淀粉含量是由基因控制的。直鏈淀粉含量在5%-15%之間的低直鏈淀粉水稻，是介于一般粘米和糯米之間的中間類型，具有食味好、冷不回生、膨化性好等特點(diǎn)，是改良稻米直鏈淀粉含量和食味品質(zhì)的理想材料。目前已經(jīng)報(bào)道了20多種低直鏈淀粉突變體,其直鏈淀粉均低于15%，胚乳外觀表型多為半透明或不透明，少數(shù)為透明的[3]。日本、韓國(guó)等東亞國(guó)家偏食軟性粳米，故對(duì)低直鏈淀粉含量水稻育種非常重視。日本自20世紀(jì)80年代中期開(kāi)始進(jìn)行低直鏈淀粉突變體誘變篩選和育種計(jì)劃，相繼育成MilkyQueen、Sari等一系列優(yōu)質(zhì)低直鏈淀粉含量品種，深受商家和消費(fèi)者歡迎。MilkyQueen是日本在1991年育成的低直鏈淀粉水稻品種，它是用N－甲基－N－亞硝基脲（MNU）處理“越光”的受精卵，獲得的低直鏈淀粉含量突變體,其直鏈淀粉含量為9%-12%。我國(guó)對(duì)低直鏈淀粉含量水稻品種選育的重視程度相當(dāng)不夠。我國(guó)云南地區(qū)特有的軟米品種,是野生稻中自然發(fā)生的低直鏈淀粉含量突變體，直鏈淀粉含量在8%-15%之間[4]。目前我國(guó)發(fā)現(xiàn)的低直鏈淀粉突變體大多數(shù)為粳稻類型，有關(guān)秈稻類型的低直鏈淀粉突變體報(bào)道較少。根據(jù)與Wx基因等位性關(guān)系的不同，可將目前已報(bào)道的低直鏈淀粉含量突變體分為與Wx等位和非等位兩大類。其中Wx-mq，Wxop等屬于與Wx等位的低直鏈淀粉含量基因，而du,lam(t)等屬于與Wx非等位的基因。Wx-mq發(fā)現(xiàn)于日本培育的低直鏈淀粉栽培品種MilkyQueen中,經(jīng)研究控制MilkyQueen的低直鏈淀粉含量的基因是1個(gè)Wx的等位基因,并命名為Wx-mq[5]，Wx-mq基因已被克隆。在尼泊爾水稻品種中發(fā)現(xiàn)的不透明胚乳自然突變體,籽粒外觀與糯稻相似,直鏈淀粉含量在10%左右,研究發(fā)現(xiàn)其低直鏈淀粉含量由1個(gè)隱性單基因控制,與Wx基因等位,將其命名為Wxop[6]。du基因是獨(dú)立于Wx的隱性單基因，該類型突變基因表型胚乳均為半透明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)8個(gè)du基因,分別命名為du-1，du-2,du-3，du-4，du-5，du(EM47)，du(2120)和du(2035)，其中du(2035)，du(EM47)位于第6染色體，du-4du-1du(2120)分別位于第4,7,9染色體上[7-9]。lam(t)基因來(lái)源于北海道品種Shiokari，該基因?yàn)榕cWx不等位的隱性單基因，位于第9染色體[10]。我國(guó)云南軟米品種毫屁、毫皮、毫木細(xì)和毫安悶的低直鏈淀粉性狀均由Wx復(fù)等位基因Wxhp控制[11]。目前du-1基因已被克隆[12]，尚未見(jiàn)到其它與Wx非等位低直鏈淀粉基因的克隆報(bào)道。對(duì)于水稻直鏈淀粉含量變化的分子機(jī)理，目前的研究主要集中于Wx復(fù)等位基因，有關(guān)非Wx低直鏈淀粉基因的調(diào)控機(jī)理研究較少。水稻中主要存在Wxa和Wxb兩種等位基因[13]，Wxa等位基因廣泛存在于秈稻，而Wxb等位基因主要存在于粳稻中。已有研究表明Wxa和Wxb的蛋白積累量主要和第一內(nèi)含子的剪接效率有關(guān)[14]，Aryes等[15]設(shè)計(jì)了SNP標(biāo)記484/w2r用于分析直鏈淀粉含量變異。另外，該剪接位點(diǎn)上游存在一個(gè)(CT)n重復(fù)序列，序列重復(fù)次數(shù)與直鏈淀粉含量具有很高的相關(guān)性,秈稻品種(CT)n重復(fù)次數(shù)相對(duì)較少，粳稻相對(duì)較多，并根據(jù)此序列設(shè)計(jì)了特異性微衛(wèi)星引物484/485[16]。上述研究主要針對(duì)直鏈淀粉含量介于15-25%之間的常規(guī)水稻品種，但這些結(jié)果仍不能很好解釋直鏈淀粉含量水平的多樣性，尤其是低直鏈淀粉含量形成機(jī)制，郭濤等[17]的研究表明，秈型低直鏈淀粉突變體XLA-1,XLA-2（CT）n多態(tài)性與糯稻相同，但其直鏈淀粉含量明顯高于糯稻，說(shuō)明還存在其它直鏈淀粉調(diào)控機(jī)制。在有關(guān)低直鏈淀粉合成調(diào)控機(jī)理方面，Zeng等[18]通過(guò)圖位克隆的方法得到了Du-1基因的全長(zhǎng)序列，分析表明，du-1基因與其野生型在第一外顯子（+1742）處存在一個(gè)堿基替換（堿基G突變?yōu)锳），從而導(dǎo)致了氨基酸序列錯(cuò)義突變（絲氨酸突變?yōu)樘扉T冬氨酸），功能研究表明du-1可能是一個(gè)淀粉合成的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)影響Wxb基因前體mRNA的剪接效率而降低直鏈淀粉含量。Isshhiki等[19]的研究表明，du-1和du-2不能形成類似于SR蛋白的剪接蛋白因子，使Wxb基因前體mRNA的正確剪接過(guò)程受到一定影響，從而導(dǎo)致直鏈淀粉含量降低。Sato等[20]克隆了Wx-mq全長(zhǎng)cDNA，與野生型Wxb基因相比，在編碼區(qū)發(fā)生了2個(gè)堿基的替換，497位的G變?yōu)锳，595位的T變?yōu)镃，從而使相應(yīng)的氨基酸序列產(chǎn)生了2個(gè)錯(cuò)義突變，推測(cè)這2個(gè)錯(cuò)義突變是造成直鏈淀粉含量下降的原因。馬曉東[18]的研究表明，四個(gè)云南軟米低直鏈淀粉基因均由Wx復(fù)等位基因Wxhp控制，該基因編碼區(qū)第四外顯子（+497個(gè)）處存在一個(gè)單堿基突變（堿基A突變?yōu)镚），編碼子由GAC突變?yōu)镚GC，導(dǎo)致了天門冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔瑔魏塑账嵬蛔兛赡軐?dǎo)致其空間構(gòu)象發(fā)生變化，不能充分結(jié)合在淀粉粒上催化直鏈淀粉的形成，從而導(dǎo)致直鏈淀粉含量降低。以上研究均來(lái)源于粳稻低直鏈淀粉突變體，由于秈型非Wx低直鏈淀粉突變基因的克隆尚未報(bào)道，因此秈稻低直鏈淀粉合成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上所述，低直鏈淀粉合成、加工和沉積途徑的分子機(jī)制目前仍尚未明晰，因此獲得各種類型的直鏈淀粉含量突變體（特別是秈型低直鏈淀粉突變體），通過(guò)各種方法克隆控制突變性狀的基因是解決上述問(wèn)題的一個(gè)有效措施，并可為稻米直鏈淀粉改良提供優(yōu)良的遺傳資源。本實(shí)驗(yàn)室利用空間誘變技術(shù)，已經(jīng)得到多個(gè)秈型低直鏈淀粉含量突變體[21]，這些突變體的獲得為深入闡明秈稻直鏈淀粉調(diào)控機(jī)理奠定了材料基礎(chǔ)。韋璇[21]對(duì)空間誘變材料秈小占的低直鏈淀粉突變體XLA-1與高直鏈淀粉品種華航一號(hào)雜交的遺傳分析表明，XLA-1與高直鏈淀粉親本雜交的F2代籽粒直鏈淀粉出現(xiàn)高低分離，且分離比例不符合3：1的分離模式，初步推測(cè)XLA-1低直鏈淀粉遺傳特性受2對(duì)隱性基因控制，它們具有連鎖關(guān)系和互補(bǔ)作用，這2對(duì)基因1對(duì)可能是Wx的等位基因，另一對(duì)可能是與Wx不等位的基因，兩者均控制直鏈淀粉合成過(guò)程中的某一個(gè)環(huán)節(jié)，任何1對(duì)基因隱性純合都將導(dǎo)致直鏈淀粉含量降低；XLA-1與糯稻的雜交后代出現(xiàn)許多介于雙親之間及超親的高直鏈淀粉含量籽粒，初步證明另1對(duì)突變基因?yàn)榉荳x的基因位點(diǎn)（暫命名為lac）。從淀粉合成關(guān)鍵酶的角度分析，XLA-1的直鏈淀粉含量下降的主因與SBE酶活性的增大關(guān)系密切。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究對(duì)XLA-1中所含有的非Wx突變基因lac進(jìn)行初步定位，研究結(jié)果對(duì)豐富水稻品質(zhì)育種基因資源具有一定的理論和實(shí)踐價(jià)值。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1水稻供試材料利用分子標(biāo)記從XLA-1/華航一號(hào)F2代群體中篩選出的目的基因型低直鏈淀粉含量品系，該品系的直鏈淀粉特性受非Wx基因lac調(diào)節(jié)（基因型為WxWxlaclac）,命名為HXLA。高直鏈淀粉個(gè)體：秈小占（WxWxLacLac）1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1雜交設(shè)計(jì)2009年6月，以低直鏈淀粉種質(zhì)HXLA為母本與高直鏈淀粉親本秈小占為父本雜交，獲得F1種子，2009年晚造自交得到F2籽粒群體。1.2.2雜交方法采用溫燙去雄法殺雄，上午8時(shí)至11時(shí)進(jìn)行。首先在保溫瓶中灌滿45℃1.2.3稻米直鏈淀粉含量的測(cè)定方法集團(tuán)法：參照GB-7648-87法，用SDM-A型旋風(fēng)式磨粉機(jī)將待測(cè)試樣的整經(jīng)米磨成粉，稱取100±0.5mg米粉樣品加入100mL容量瓶，加入1.0mLφ=95%酒精使其分散，9.0mL1mol/LNaOH煮沸10min，冷卻定容，吸取5.0mL樣品溶液移入另一100mL容量瓶（同時(shí)吸取5.0mL0.09mol/LNaOH作為對(duì)照），加入1.00mL1mol/L乙酸、1.50mLI2-kI溶液，定容，20min后用分光光度計(jì)測(cè)定620nm下吸光值（OD620nm）。集團(tuán)法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取與待測(cè)樣品保存在同樣的條件下三天以上的高、中、低已知直鏈淀粉含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品各100mg，用上述方法與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。以標(biāo)樣的直鏈淀粉為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和列出曲線的回歸方程式。重復(fù)測(cè)定一次，兩次結(jié)果的誤差應(yīng)在1.0%，取平均值即為直鏈淀粉含量。單粒法：將單粒去殼去胚后，放入25mL容量瓶，加入0.25mLφ=95%酒精及2.25mL1mol/LNaOH后，置于恒溫箱26℃糊化24h，使胚乳完全溶解。之后將容量瓶取出，振蕩搖勻后煮沸10min，冷卻定容吸取1.25mL樣品溶液移入另一25mL容量瓶（同時(shí)吸取1.25mL0.09mol/LNaOH作為對(duì)照），加入0.25mL1mol/L乙酸、0.375mLI2單粒法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取高、中、低已知直鏈淀粉含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品各0.0100g，用上述方法與待測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)定。以表樣直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，以相對(duì)應(yīng)的吸光值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和列出曲線的回歸方程式。親本的直鏈淀粉含量及HXLA/秈小占F1單株測(cè)定采用集團(tuán)法，HXLA/秈小占F2的遺傳分析采用單粒法。1.2.4作圖群體的DNA獲得HXLA/秈小占的F2籽粒群體采用單粒法測(cè)定，把單粒分成兩部分，胚乳用于直鏈淀粉含量的測(cè)定，保留胚，并編號(hào)一一對(duì)應(yīng)。把小于13.5%及大于22.5%的籽粒胚置于恒溫箱發(fā)芽，用營(yíng)養(yǎng)液澆灌至三葉期，長(zhǎng)出足夠多的葉片可提取DNA，用于構(gòu)建作圖群體。1.2.5水稻基因組總DNA提取采用MurrayCTAB方法提取。1.2.6SSR標(biāo)記篩選及候選基因標(biāo)記確定韋璇[21]等利用XLA-1/華航一號(hào)雜交構(gòu)建F2代群體，經(jīng)遺傳分析和蠟質(zhì)基因Wx的(CT)n多態(tài)性分析表明，控制XLA-1低直鏈淀粉特性的另一對(duì)基因與Wx基因連鎖。根據(jù)上述研究，為快速確定該低直鏈淀粉基因，首先采用分離群體法（BulkedSegregantAnalysis,BSA）篩選與低直鏈淀粉基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，即利用HXLA與秈小占及高直鏈淀粉池與低直鏈淀粉池作為篩選模板進(jìn)行擴(kuò)增，待篩選出合適的SSR標(biāo)記后進(jìn)一步對(duì)高直鏈淀粉個(gè)體及低直鏈淀粉個(gè)體進(jìn)行確定，確保標(biāo)記的準(zhǔn)確性。候選標(biāo)記確定后，再根據(jù)隱性群體法（Recessive-classanalysis,RCA）對(duì)F2作圖群體的低直鏈淀粉個(gè)體進(jìn)行確定，確定連鎖位置與遺傳距離。1.2.7近等基因池的構(gòu)建從HXLA/秈小占F2代定位群體中隨機(jī)選取10個(gè)高直鏈淀粉籽粒個(gè)體的DNA等量混合成高直鏈淀粉基因池，同樣方法選取10個(gè)低直鏈淀粉籽粒個(gè)體的DNA等量混合成低直鏈淀粉基因池。1.2.8電泳檢測(cè)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，大約3-4小時(shí)，結(jié)束后，雙蒸水洗膠兩次，每次約1分鐘，再用1g/L的AgNO3溶液染色約10分鐘，用雙蒸水洗膠兩次，用顯影液搖動(dòng)顯影然后觀察分析。1.2.9連鎖分析本研究采用隱性群體法進(jìn)行連鎖分析，重組率按Kosambi作圖函數(shù)轉(zhuǎn)換成遺傳距離（里摩爾根cM）。2結(jié)果分析2.1F1代直鏈含量測(cè)定結(jié)果從表2.1可以看出，HXLA與秈小占雜交得到的F1代籽粒直鏈淀粉含量居于雙親之間，其籽粒直鏈淀粉含量平均值低于中親值（20.95%<21.65%），且多數(shù)偏向于高直鏈淀粉含量親本，說(shuō)明高直鏈淀粉含量對(duì)低直鏈淀粉含量表現(xiàn)不完全顯性，控制XLA-1低直鏈淀粉含量的突變基因?qū)儆陔[性基因。表2.1HXLA/秈小占F1代及親本直鏈淀粉含量表現(xiàn)值組合直鏈淀粉含量（%）♀♂F1MPF1-MPHXLA/秈小占17.4124.3720.9521.650.182.2F1代真種的分子標(biāo)記鑒定XLA-1低直鏈淀粉遺傳特性受2對(duì)隱性基因控制，因此要排除Wx基因的影響，此外還要驗(yàn)證雜交是否成功，本研究采用分子標(biāo)記輔助的方法，對(duì)F1的植株逐一進(jìn)行檢測(cè)，保證遺傳分析及分子定位的準(zhǔn)確性。首先采用特異引物484/485特異引物進(jìn)行(CT)n多態(tài)性鑒定，如圖2.1所示，選取只有和雙親相同帶型的植株，即編號(hào)為1、2、3、8、9；接著用雙親具有多態(tài)的引物RM225進(jìn)行鑒定，如圖2.2所示，選取雜合帶型的植株，即編號(hào)為1、4、5、6、7、9、10。綜合篩選滿足條件的有1號(hào)植株，因此選取1號(hào)進(jìn)行遺傳分析及分子定位。P1P212345678910P1P212345678910圖2.1HXLA/秈小占的F1在484/485特異引物擴(kuò)增表現(xiàn)注：P1代表HXLA，P2代表秈小占，標(biāo)號(hào)1-10代表HXLA/秈小占F1單株MP1P212345678910MP1P212345678910圖2.2HXLA/秈小占的F1在RM225引物擴(kuò)增表現(xiàn)注：P1代表HXLA，P2代表秈小占，標(biāo)號(hào)1~10代表HXLA/秈小占F1單株2.3F2代低直鏈淀粉基因的遺傳分析HXLA與秈小占雜交組合F2代籽粒群體的直鏈淀粉含量頻次分布圖如2.3，分離情況見(jiàn)表2.2。由圖2.3可以看出，HXLA與秈小占雜交F2代籽粒群體直鏈淀粉含量出現(xiàn)明顯3個(gè)峰，結(jié)合表2.2可知，低直鏈淀粉分界點(diǎn)為15%，高直鏈淀粉分界點(diǎn)為19%，其分離范圍為5.79%~27.50%。圖2.3HXLA/秈小占雜交組合F2代籽粒群體的直鏈淀粉含量頻次圖表2.2HXLA/秈小占雜交組合F2代籽粒群體變異范圍組合F2平均值分離范圍低AC分界點(diǎn)（%）高AC分界點(diǎn)（%）HXLA/秈小占16.76%5.79~27.501519卡平方檢測(cè)結(jié)果表明（見(jiàn)表2.3），HXLA/秈小占雜交組合F2代籽粒群體的直鏈淀粉含量分離比例符合1：2：1遺傳分離模式，即低直鏈淀粉含量個(gè)體：高直鏈淀粉含量個(gè)體為1：3遺傳分離，且χ2=2.07<χ20.05，根據(jù)孟德?tīng)柣蚍蛛x規(guī)律可知，低直鏈淀粉性狀符合一對(duì)基因遺傳分離模式，說(shuō)明控制XLA-1低直鏈淀粉特性的基因是由一對(duì)隱性基因控制。表2.3HXLA/秈小占雜交組合F2代籽粒群體卡平方檢測(cè)結(jié)果組合AC分組總數(shù)實(shí)際比例χ2低中高HXLA/秈小占1363534892.59：12.07χ20.05=3.84（df=1）2.4作圖群體的構(gòu)建根據(jù)遺傳分析的結(jié)果，在F2代籽粒分離群體的136個(gè)低直鏈淀粉個(gè)體中隨機(jī)選取直鏈淀粉含量小于13.5%的個(gè)體60個(gè)，構(gòu)建作圖群體，利用隱性群體法對(duì)低直鏈淀粉基因進(jìn)行連鎖分析及初步定位。2.5與低直鏈淀粉基因連鎖的SSR標(biāo)記連鎖分析及分子定位為了確定低直鏈淀粉突變基因的位置，我們?cè)赪x上端及下端處選取40對(duì)SSR引物，對(duì)親本HXLA和秈小占進(jìn)行多態(tài)性篩選，在Wx基因上端處發(fā)現(xiàn)RM19254-RM19271-RM19283-RM19288-RM19289-RM19297出現(xiàn)連續(xù)的多態(tài)，通過(guò)近等基因池的鑒定，電泳檢測(cè)結(jié)果表明位于第六染色體的標(biāo)記RM19288和RM19297在高直鏈淀粉基因池、低直鏈淀粉基因池以及兩親本中存在多態(tài)性，因此將這兩對(duì)標(biāo)記確定為候選基因。接著用作圖群體來(lái)確定這兩個(gè)標(biāo)記與低直鏈淀粉基因的連鎖關(guān)系，我們用這兩個(gè)標(biāo)記分別對(duì)作圖群體中的60個(gè)體分別檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)雙親和近等基因池作為對(duì)照。結(jié)果表明在RM19288位點(diǎn)上鑒定到6個(gè)重組體，RM19297位點(diǎn)上鑒定到5個(gè)重組體（圖2.4和圖2.5）。重組率按Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)為為遺傳距離（里摩爾根cM），計(jì)算結(jié)果得出該突變基因lac位于RM19288、RM19297之間，與RM19288的距離為5.05cM，與RM19297的距離為4.1cM（圖2.6）。MM47913P1P2HL123568101112141516171819202122232425262728293045454644P1L343740P2H31323335363839414243M5358474849505152545556575960圖2.4SSR標(biāo)記RM19288對(duì)60個(gè)F2代低AC個(gè)體的檢測(cè)結(jié)果注：M代表100bpladder,P1代表秈小占，P2代表HXLA，H代表高池，L代表矮池，1-60帶代表60個(gè)F2作圖個(gè)體MM47913P1P2HL123568101112141516171819202122232425262728293045454644P1L343740P2H31323335363839414243M5358474849505152545556575960圖2.5SSR標(biāo)記RM19297對(duì)60個(gè)F2代低AC個(gè)體的檢測(cè)結(jié)果注：M代表100bpladder,P1代表秈小占，P2代表HXLA，H代表高池，L代表矮池，1-60帶代表60個(gè)F2作圖個(gè)體圖2.6低直鏈淀粉基因lac的局部分子標(biāo)記連鎖圖3小結(jié)與討論迄今為止，已報(bào)道的非Wx主效基因控制直鏈淀粉含量的基因都來(lái)自于粳稻，而來(lái)自秈稻尚未報(bào)道。秈稻低直鏈淀粉含量主要是受Wx基因的復(fù)等位基因控制，例如Wx-mq、Wxop、Wxmp。位于第6染色體染色體控制低直鏈淀粉含量的基因主要是du-2、du(2035)，都是由親本Sasanishiki通過(guò)EMS突變方式定位出來(lái)。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)水稻直鏈淀粉的遺傳機(jī)理進(jìn)行了不少研究，但由于直鏈淀粉直鏈淀粉含量遺傳的復(fù)雜性，使得研究結(jié)果眾說(shuō)紛紜。多數(shù)研究者認(rèn)為稻米直鏈淀粉含量受控于一個(gè)主效基因和幾個(gè)微效基因，不同品種所帶的主效基因不同。李廣賢[23]等報(bào)道在第1、3、4、5、6、7、8、9、12染色體上均有檢測(cè)到該性狀的QTL報(bào)道。綜合前人的研究，水稻第6染色體上存在一個(gè)控制直鏈淀粉含量的Wx基因位點(diǎn)，黃祖六[24]等對(duì)稻米直鏈淀粉含量基因座位進(jìn)行分子標(biāo)記研究，表明位于第6染色體的Wx基因與R1962緊密連鎖，距離為3.6cM,另外還在第3染色體上檢測(cè)到一個(gè)與R2170緊密連鎖的主效基因，且兩個(gè)基因之間的作用是獨(dú)立的。本研究結(jié)果表明，低直鏈淀粉基因lac位于第6染色體上端的SSR標(biāo)記RM19288、RM1929之間，分別相距5.05cM和4.1cM，且位于Wx基因的上端。通過(guò)與du-2、du(2035)相比對(duì)，發(fā)現(xiàn)XLA-1產(chǎn)生的低直鏈淀粉基因與du-2、du(2035)不等位，結(jié)合遺傳分析結(jié)果表明lac為一新的低直鏈淀粉含量基因。通過(guò)對(duì)該基因的獲得，豐富了水稻的低直鏈淀粉基因資源，也為該基因的精細(xì)定位和圖位克隆研究打下了良好的基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)[1]沈鎮(zhèn)昭,梁書升.中國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2006:30-39.[2]蔡秀玲劉巧泉顧銘洪等用于篩選直鏈淀粉含量為中等的秈稻品種的分子標(biāo)記植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)2002.28（2）：137-144[3]朱昌蘭，沈文飚,翟虎渠,等.水稻低直鏈淀粉含量基因育種利用的研究進(jìn)展.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2004，37(2):157-162.[4]曾亞文,申時(shí)全,楊忠義,等.云南稻種資源的蒸煮食味品質(zhì)研究.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,23(5):408-41.[5]SatoH,SuzukiY,OkunoK,etal.Geneticanalysisoflow-amylosecontentinaricevariety'MilkyQueen'.JapanBreedingResearch,2001,3:13-19.[6]MikamiI,AikawaM,HiranoHY,etal.Alteredtissue-specificexpressionattheWxgeneofopaquemutantsinrice.Euphytica,1999,105:91-97.[7]OkunoK,NagamineT,OkaM.Newlinesharboringdugenesforlowamylasecontentinendospermstarchofrice.JapanAgriculturalResearchQuarterly,1993,27:102-1