T-BPMA 24-2024 生活飲用水中諾如病毒定量檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR方法

BPMAQuantitativedetectionofNorovirusindrinkingwater—I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定全所、北京市疾病預(yù)防控制中心、北京市朝北京市懷柔區(qū)疾病預(yù)防控制中心、北京市昌平區(qū)疾病預(yù)防控制中心、北京市大興區(qū)疾病預(yù)防控制中心李冬梅、侯宛祺、鄧富昌、侯敏、鄭旭、周2生活飲用水中諾如病毒定量檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR方法本文件描述了生活飲用水中諾如病毒富集和實(shí)時(shí)熒光定量檢本文件適用于市政管網(wǎng)末梢水、二次供水、自備井水中GB/T5750.2生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法水樣的采集與注：諾如病毒分10個(gè)基因群GI~GX，GI、GII是引起人類急性胃腸炎的4設(shè)備和材料4.3渦旋振蕩器。4,4核酸提取儀。GI上游引物：5’-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3’GI下游引物：5’-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’GI探針：5’-VIC-TGGACAGGAGAYCGC-MGB-3’GII上游引物：5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’GII下游引物：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’GII探針：5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-BHQ1-3’35.4諾如病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒：線性化標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。如：6.2樣本的運(yùn)輸與保存0℃~4℃條件下儲(chǔ)存和運(yùn)輸，于2h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。24及實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timeRT-PCR6.3病毒富集6.4核酸檢測(cè)按照RNA提取試劑盒說明書，取200μL洗脫液(V2)進(jìn)行核酸提取，提取的RNA存脫液體積（V1提取完成后應(yīng)立即封蓋，置于冰上，并馬上進(jìn)行Real-t液和RNA樣本應(yīng)置于-86℃~-40℃冰箱凍存，避體積(μL）———46.4.2.2參照諾如病毒核酸檢測(cè)試劑盒溫度(℃)112136.5標(biāo)準(zhǔn)曲線拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Ct值作為縱坐標(biāo)，分別繪制諾如病毒GI基因組和諾如病毒GII基因組的標(biāo)準(zhǔn)。C0=10························7.2結(jié)果判定需滿足以下質(zhì)量控制要求，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，且Ct≤30；陰性對(duì)照無典或Ct≥45；空白對(duì)照無典型擴(kuò)增曲線或Ct≥45。否則，檢驗(yàn)結(jié)果無效。待測(cè)樣品的Ct值大于等于45時(shí),判定為諾如病毒陰性。待測(cè)樣品的Ct值≤38時(shí),曲線為S型，判定為諾如病毒陽(yáng)性。待測(cè)樣品的Ct值>38,＜45時(shí),應(yīng)重新檢測(cè)；重新檢測(cè)結(jié)果≥45時(shí),判定為諾如病毒陰性；若重新檢測(cè)結(jié)果＜45，曲線為S注：若使用諾如病毒核酸檢測(cè)試劑盒則參照試劑盒說明書進(jìn)行根據(jù)公式（3）計(jì)算生活飲用水樣本中的諾如拷貝濃度，單位為copi·················································5V1—核酸提取后RNA模板的體積，單位：μL。7