第十七章 醫(yī)藥基因工程課件

18醫(yī)藥基因工程第十七章醫(yī)藥基因工程18醫(yī)藥基因工程自１９７２年ＤＮＡ重組技術誕生以來，基因工程技術得到飛速發(fā)展，并在醫(yī)療領域中展露出獨特的優(yōu)越性?；蚬こ趟幬锞褪抢没蚬こ碳夹g生產(chǎn)的藥物。基因工程藥物是將藥物蛋白或多肽的編碼基因通過特定的受體細胞中，通過受體生物或者細胞表達出藥物蛋白或多肽，最后將其純化并制成藥劑的過程?；蚬こ趟幬锷a(chǎn)的過程與其他基因工程產(chǎn)品的基本原理是相通的，基本過程都包括了載體構建，工程菌或細胞培養(yǎng)，目的產(chǎn)物的分離純化與鑒定等。18醫(yī)藥基因工程從１９８２年最早的基因工程藥物－－胰島素上市到２００４年底，已經(jīng)有１００多種基因工程藥物通過審查并上市，另外還有３００多種基因工程藥物進入二期及三期臨床實驗，涉及治療１５０多種疾病。我國于１９９３年批準了第一個基因工程藥物重組人干擾素a－１b的生產(chǎn)，標志著我國基因工程藥物生產(chǎn)實現(xiàn)了零的突破。我國藥品市場上基因工程藥品主要有基因工程乙肝疫苗，重組干擾素，重組人紅細胞生成素等２２種自主開發(fā)的基因工程藥物。18醫(yī)藥基因工程第一節(jié)基因工程藥物的開發(fā)狀況18醫(yī)藥基因工程一.基因工程藥物的分類１.按照結構組成不同分類：蛋白多肽類藥物，基因工程疫苗和核酸類藥物三類。２.按照作用方式分類：基因水平作用藥物，轉錄水平作用藥物和蛋白質(zhì)水平作用藥物。18醫(yī)藥基因工程３.按照藥物作用機理分類：其一：蛋白或多肽藥物，通過蛋白自身的生理生化特性而抵抗疾病其二：基因工程疫苗，基因工程抗體和ＤＮＡ疫苗，基于抗原抗體反應的原理而抵抗疾病其三：反義核酸，核酶和ＲＮＡi，基于中斷基因表達而抵抗疾病。18醫(yī)藥基因工程二.基因工程藥物的發(fā)展１.反應器的變遷根據(jù)反應器的不同可將蛋白多肽類基因工程藥物的發(fā)展分為三個階段：

a.早期大多數(shù)蛋白多肽類基因工程藥物通過細菌和酵母等微生物來表達。

b.后來發(fā)展了真核生物細胞表達系統(tǒng)，利用離體培養(yǎng)的昆蟲細胞和脊椎動物（如哺乳動物和鳥類）細胞表達蛋白多肽類藥物。

c.近年來發(fā)展的動植物生物反應器為基因工程藥物的開發(fā)帶來美好的前途。18醫(yī)藥基因工程２.從基因工程到蛋白質(zhì)工程隨著技術的進步，人們通過蛋白質(zhì)工程可獲得修改了氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽。通過定點突變、功能域的交換、分子進化等手段，已經(jīng)開發(fā)了一些活性提高、適應性改善和專一性增強的蛋白藥物。３.從蛋白藥物到核酸藥物

傳統(tǒng)藥物是通過增加某些人體內(nèi)源性的有益蛋白多肽或者破壞致病蛋白本身來治療疾??；而核酸類基因工程藥物則是提供產(chǎn)生蛋白的基因，通過破壞或者擴大基因的功能來克服疾病?；蚬こ趟幬锏拈_發(fā)關鍵在于探知什么蛋白或多肽、或核酸可以成為藥物，已經(jīng)通過什么樣的方式制備藥物或通過什么樣的方式使用藥物。18醫(yī)藥基因工程三.基因工程藥物的產(chǎn)業(yè)化狀況第一個基因工程藥物－－基因工程人胰島素的問世期間經(jīng)歷了不到十年。至１９７６年第一個以基因工程制藥為對象的美國Ｇenentech公司成立以來，有藥物進入臨床實驗的生物技術公司已有約５００個。在２００２年，超過８０種基因工程藥物獲準在美國和歐盟使用，７５０中正在進行臨床實驗，市場份額超過１５０億美元。我國共有２２種基因工程藥物和疫苗，其中４種為具有自主知識產(chǎn)權的”一類“新藥，進入臨床研究的大約有１５０種，銷售收入超過３億人民幣。18醫(yī)藥基因工程表18醫(yī)藥基因工程第二節(jié)基因工程蛋白和多肽藥物18醫(yī)藥基因工程一.基因工程胰島素１.胰島素與糖尿病

胰島素（insulin）是一種激素，能夠調(diào)節(jié)糖代謝，促進葡萄糖轉變?yōu)樘窃Υ嬗诩∪夂透蝺?nèi)。當人體胰腺的Ｂ－細胞不能產(chǎn)生足量的胰島素時，就會導致人體內(nèi)的葡萄糖濃度增高，并伴隨因胰島素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，即糖尿病。而對于胰島功能完全消失的Ⅰ型糖尿病患者，不注射胰島素就無法維持生命。18醫(yī)藥基因工程２.胰島素的結構胰島素是一種由兩條多肽鏈（Ａ鏈和Ｂ鏈）組成的蛋白質(zhì)。Ａ鏈含有２１個氨基酸，Ｂ鏈含有３０個氨基酸，鏈間通過二硫鍵結合。胰島素在人體內(nèi)合成的過程中首先合成前胰島素原（preproinsulin），包括信號肽序列、Ａ鏈、Ｂ鏈和連接序列４個部分。胰島素是經(jīng)過去掉信號肽序列后形成胰島素原，去掉連接序列后剩下的Ａ鏈和Ｂ鏈通過二硫鍵結合，形成了胰島素。（圖１８—１）18醫(yī)藥基因工程18醫(yī)藥基因工程３.基因工程胰島素的生產(chǎn)方式主要有兩種生產(chǎn)方式：

a.利用大腸桿菌為受體，分別表達胰島素Ａ鏈和Ｂ鏈，再分別提取和純化產(chǎn)生的Ａ鏈和Ｂ鏈，最后利用化學方法使兩條鏈之間形成二硫鍵，從而得到胰島素。

b.以酵母為受體分泌表達人胰島素。在胰島素編碼基因前段增加一個信號肽編碼序列，這個信號肽引導合成的胰島素從細胞內(nèi)分泌到周圍的培養(yǎng)基中，從而簡化了胰島素的純化過程，最后通過酶學反應使之變成人胰島素。18醫(yī)藥基因工程二.基因工程人紅細胞生成素１.人紅細胞生成素的組成和生物活性

成熟的人紅細胞生成素（ＥＰＯ）是一種由１６５個氨基酸組成的糖蛋白，多肽結構中由４個半胱氨酸形成２條二硫鍵，相對分子質(zhì)量為３４×１０３

ＥＰＯ又稱促紅細胞生成素或紅細胞生產(chǎn)刺激因子，是一類造血生長因子，刺激和調(diào)節(jié)哺乳動物紅細胞的生成，維持外周血紅細胞處于正常水平。

腎是產(chǎn)生ＥＰＯ的主要器官，目前只有應用基因工程技術生產(chǎn)ＥＰＯ才能滿足患者的需求。18醫(yī)藥基因工程２.重組紅細胞生成素的生產(chǎn)人類ＥＰＯ位于第７號染色體長２２區(qū)，１９８５年克隆到其cＤＮＡ。由于糖基化的問題，目前只利用脊椎動物表達系統(tǒng)來生產(chǎn)人紅細胞生成素，其糖基化特性與人體中自然產(chǎn)生的糖基化特性最相近。方法：通過將編碼人紅細胞生成素的基因裝入哺乳動物細胞表達載體，轉染二氫葉酸還原酶缺陷的ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－dhfrˉ）株，并進一步篩選獲得高產(chǎn)人紅細胞生成素的ＣＨＯ。經(jīng)過一系列細胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)純化等工藝制備過程，產(chǎn)生有生物學活性的重組人ＥＰＯ?，F(xiàn)在上市的紅細胞生成素主流產(chǎn)品都是通過基因重組技術，利用中國倉鼠卵巢細胞（Ｃhinese

hamster

ovary，ＣＨＯ）生產(chǎn)的。18醫(yī)藥基因工程三.基因工程干擾素１.干擾素的結構組成、生物活性和臨床應用

干擾素（interferon，ＩＦＮ）是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性糖蛋白細胞因子，最早于１９５７年發(fā)現(xiàn)。干擾素是一類多功能細胞因子，按其結構和功能的差異可以分為三類，即干擾素α

、干擾素β和干擾素γ。干擾素α含有２３種不同的亞型，干擾素β和干擾素γ都只有１種亞型。干擾素α的成熟產(chǎn)物由１６５～１６６個氨基酸組成，其中含４個半胱氨酸，形成對生物活性至關重要的２個二硫鍵。干擾素α主要由白細胞、Ｂ淋巴細胞、成纖維細胞和一些腫瘤細胞分泌；臨床上主要用來治療白血病，以及一些慢性病毒，如乙型肝炎、丙型肝炎和皰疹病毒感染。

18醫(yī)藥基因工程2.基因工程干擾素的生產(chǎn)早期制備是通過誘導或重組誘導天然或人工培養(yǎng)的人體細胞或血細胞產(chǎn)生天然干擾素。利用基因工程生產(chǎn)干擾素：

a.先要獲得干擾素的編碼基因；

b.利用誘生劑誘導細胞表達干擾素；

c.然后提取干擾素的mＲＮＡ，反轉錄成cＤＮＡ；

d.將干擾素編碼基因通過合適的表達載體，導入大腸桿菌進行表達可產(chǎn)生大量干擾素；

e.經(jīng)過分離純化便可制成藥物制劑。18醫(yī)藥基因工程四、基因工程疫苗疫苗的定義：由滅活或減毒的病原體做成的可預防相應病原物引起疾病的藥物，通過接種人或動物在其體內(nèi)建立抗感染免疫反應而產(chǎn)生保護作用。１.基因工程疫苗的分類：

a.亞單位疫苗。指用病原體的組分制成的疫苗，包括病毒的結構蛋白和細菌的脫毒毒素蛋白，其中病毒的結構蛋白是指病毒組成成分中能引起人體對病毒顆粒產(chǎn)生免疫反應且不致病的蛋白組分；細菌脫毒毒素蛋白是利用ＤＮＡ重組技術在基因水平上對細菌的毒素蛋白進行脫毒所獲得的基因工程疫苗。

b.無毒疫苗或減毒活疫苗。利用ＤＮＡ重組技術去掉致病菌的毒素基因后得到的即保留了其侵入細胞和刺激免疫系統(tǒng)的能力，卻又不能引起疾病的減毒病原菌。

c.疫苗載體。把目的基因轉到已經(jīng)在臨床上使用的安全的活疫苗中，利用該活疫苗作為載體表達目的抗原基因，從而達到針對某種傳染病的免疫保護作用。

18醫(yī)藥基因工程２.重組乙型肝炎疫苗乙型肝炎的定義：由乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）引起的、以肝為主要病變并可累及多器官損害的一種傳染病。乙型肝炎病毒顆粒由囊膜和含有ＤＮＡ分子的核衣殼組成，又稱Ｄane顆粒。最初的乙型肝炎疫苗都是血液乙型肝炎疫苗，是從乙型肝炎患者血液中分離提取乙型肝炎表面抗原（ＨＢsＡg）。疫苗的制備一般選定具有免疫原性的乙型肝炎表面抗原基因片段，將起插入表達載體，并引入到與表達載體相對應的宿主細胞，構成重組體。重組體像一個加工廠，可以表達、加工、生產(chǎn)出乙型肝炎表面抗原，即得到基因工程疫苗。18醫(yī)藥基因工程（１）.重組酵母乙型肝炎疫苗用來表達抗原的酵母主要是釀酒酵母、漢遜酵母和畢赤酵母。表達質(zhì)粒上用來在酵母中表達ＨＢsＡg的主要部件有３個：⑴在酵母中表達ＨＢsＡg的啟動子。⑵不含有內(nèi)含子的乙型肝炎病毒ＨＢsＡg的基因。⑶在酵母細胞中終止ＨＢsＡg轉錄的ＤＮＡ序列。利用酵母細胞表達ＨＢsＡg存在缺點：⑴酵母細胞不能分泌ＨＢsＡg顆粒；⑵酵母細胞對ＨＢsＡg蛋白的糖激化與哺乳動物的不同，使得獲得的酵母ＨＢsＡg可能具有與血液ＨＢsＡg不同的免疫原性；⑶在酵母中裝配２２nmＨＢsＡg

顆粒不穩(wěn)定；⑷酵母細胞產(chǎn)生的ＨＢsＡg需要化學方法處理才能與血液的ＨＢsＡg相同，在這過程中可能改變ＨＢsＡg分子的結構，從而減小ＨＢsＡg抗原性。18醫(yī)藥基因工程（２）.重組中國倉鼠卵巢細胞（ＣＨＯ）乙型肝炎疫苗將乙型肝炎表面抗原基因片段重組到中國倉鼠卵巢細胞（ＣＨＯ）內(nèi)，通過對細胞的培養(yǎng)增殖，分泌乙型表面抗原（ＨＢsＡg）于培養(yǎng)液中，經(jīng)純化，加佐劑氫氧化鋁后制成疫苗。優(yōu)點：⑴ＣＨＯ乙型肝炎疫苗產(chǎn)生的ＨＢsＡg的糖基化與血液ＨＢＶ顆粒的糖基化一樣；⑵產(chǎn)生的ＨＢsＡg顆粒是以自然方式裝配的，而不需要其他的化學處理；⑶裝配的２２nmＨＢsＡg顆粒最后會被分泌到培養(yǎng)基中，不需要裂解細胞，簡化了純化步驟；⑷成本不高，有利于那些負擔不起現(xiàn)有的高價疫苗的患者。18醫(yī)藥基因工程五.基因工程抗體抗體的定義：是機體受抗原刺激后由Ｂ淋巴細胞產(chǎn)生，并且能與該抗原發(fā)生特異性結合的具有免疫功能的球蛋白，是體液免疫應答中發(fā)揮免疫功能的最主要的免疫分子，主要分布與血清中，在組織液和外分泌液中也存在。常規(guī)抗體是針對多種不同抗原決定蔟產(chǎn)生的抗體，又稱多克隆抗體；而針對某種抗原決定蔟的抗體稱單克隆抗體，一般由雜交瘤細胞分泌。在臨床上，抗體可用于抗腫瘤、抗感染、抗器官移植排斥反應、抗血栓形成和解毒，以及構建獨特型疫苗、治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應疾病，此外還可用于體外診斷和發(fā)揮體內(nèi)藥物導向作用?；蚬こ炭贵w在臨床上可發(fā)揮更多更重要的作用。18醫(yī)藥基因工程第三節(jié)基因工程抗體18醫(yī)藥基因工程一.抗體的結構抗體分子是由４條多肽鏈組成的四聚體，即由２條相同的輕鏈（Ｌ）和２條相同的重鏈（Ｈ）組成，重鏈之間以及輕鏈之間通過二硫鍵連接，呈Ｙ字型結構（圖１８－２）。重鏈由４５０個氨基酸組成（如抗體ＩgＧ），輕鏈由２１４個氨基酸組成，完整抗體的相對分子質(zhì)量約為１５０×１０３?？乖淖R別位點位于輕鏈和重鏈的Ｎ端區(qū)域，該區(qū)稱稱作抗體的可變區(qū)（Ｖ區(qū)），識別位點就在Ｖ區(qū)內(nèi)的３個互補決定區(qū)（ＣＤＲ），也稱超變區(qū)，每個ＣＤＲ長約５～１６個氨基酸。Ｖ區(qū)以外的部分稱為框架區(qū)（ＦＲ），其氨基酸序列相對保守，不與抗原分子直接結合，可維持抗體的空間構型?？贵w分子含有多個功能區(qū)，除Ｖ區(qū)外，每一條輕鏈含有１個保守區(qū)（Ｃ區(qū)）ＣＬ，每一個重鏈含有３個保守區(qū)（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）。18醫(yī)藥基因工程18醫(yī)藥基因工程二.天然抗體的局限性抗原有多種不同抗原決定蔟，可刺激產(chǎn)生多克隆抗體。這種抗原是不均一的，會影響檢測抗原的特異性及敏感性，在臨床上應用受到很大限制。單克隆抗體的定義：是由識別一種抗原決定蔟的細胞克隆所產(chǎn)生的均一抗體，可視為第二代抗體，具高度特異性、均一性，且親和力強、效價高，在臨床上發(fā)揮了重要作用。單克隆抗體在臨床中的問題：⑴單克隆抗體具有免疫原性；⑵雜交瘤制備的單克隆抗體在人體內(nèi)的半衰期只有５～６h，不利于藥效發(fā)揮作用；⑶吸收差，抗體相對分子質(zhì)量大，很難通過血管進入細胞間隙，大大降低治療效果；⑷生產(chǎn)復雜，價格較高。18醫(yī)藥基因工程三.基因工程抗體的種類１.單克隆抗體的人源化為了解決鼠源抗體的免疫原性問題，應改造抗體，構建人－鼠嵌合抗體和人源化抗體。

a.人－鼠嵌合抗體通過基因重組，將鼠源單克隆抗體的Ｆv片段替換人源抗體的相應片段，制成人－鼠嵌合抗體（圖１８－３）。７０％序列來自人源抗體，３０％序列來自鼠源抗體；可保留抗體的特異性結合位點，也可減弱其免疫原性。

b.人源化抗體是對嵌合抗體進一步改進的結果，即用鼠源單克隆抗體的ＣＤＲ所獲得的雜合抗體，９５％序列來自人源抗體，５％的序列來自鼠源抗體，最大限度地使鼠源抗體人源化（圖１８－４）?？贵w的抗原結合特性保留，在人體內(nèi)產(chǎn)生免役原性的程度降到最低。18醫(yī)藥基因工程

18醫(yī)藥基因工程２.小分子抗體為了解決穿透性問題，對抗體改造，保留抗原結合位點，成為小分子抗體，分為下面５種：

a.Ｆab抗體抗體的Ｆab片段由重鏈的Ｖ區(qū)和Ｃm區(qū)與輕鏈以二硫鍵相連，能發(fā)揮抗體的抗原結合功能，大小為完整抗體的１／３。

b.單鏈抗體將抗體的ＶＨ和ＶＬ用連接肽連接，形成具有抗原結合能力的單鏈抗體多肽，即所謂的單鏈抗體（ＳcＦv）。其大小僅為完整抗體的１／６，免疫原性弱，藥物動力學優(yōu)于Ｆab片段和完整抗體，能有效到達完整抗體無法達到的靶部位。18醫(yī)藥基因工程

c.單域抗體抗體結合抗原的部位主要在Ｖ區(qū)，只含有Ｖ區(qū)的小分子抗體，如ＶＨ或ＶＬ，也能保持原單克隆抗體的特異性，這種小分子抗體稱為單域抗體，其大小為完整抗體的１／１２，其只有一個功能區(qū)，制備簡單，更容易穿過靶細胞。

d.超變區(qū)多肽由單個ＣＤＲ多肽構成的小分子抗體稱為超變區(qū)多肽，其只有１６～３０個氨基酸，具有與抗原結合的能力，穿透力極強。但親和力低，穩(wěn)定性不高，實際應用有很大局限性。

e.雙體抗體將兩種不同抗體的ＶＨ區(qū)和ＶＬ區(qū)通過連接肽（５～１０個氨基酸）連接，形成“雜交”的單鏈抗體稱作雙體抗體（diabody），也稱雙特異性抗體。在宿主細胞中表達后，２條鏈自動折疊，形成雙特異性的抗體片段，其大小為ＩgＧ的１／３或Ｆab的１／２，是相對分子質(zhì)量最小的雙功能抗體，在免疫診斷和治療方面有廣闊的應用前景。18醫(yī)藥基因工程３.雙功能抗體雙功能抗體的定義：天然的抗體分子是雙價單特異性的，將小分子抗體（如Ｆab或Ｆv）與其他蛋白如毒素、酶、細胞因子及受體分子連接在一起，可形成一種新型分子，這樣的雜和分子稱雙功能抗體。雙功能抗體即可以與靶位點結合，又可將特定的活性分子導向特定部位，發(fā)揮其生物學功能，如殺死腫瘤細胞、發(fā)揮催化功能等。將人細胞受體或黏附分子與抗體的恒定區(qū)（主要是Ｆc片段）的Ｎ段連接，形成免疫黏連素，既可發(fā)揮抗體的效應功能，又能發(fā)揮細胞黏附功能。對于殺傷缺少相應表面抗原的腫瘤細胞有一定意義，可減少腫瘤的免疫逃逸。18醫(yī)藥基因工程４.人源性抗體制備人源單克隆抗體的２種方法：

a.噬菌體抗體庫噬菌體抗體庫技術是噬菌體表面展示技術在基因工程抗體應用上的一個成功范例；通過噬菌體表面展示技術，可將目的蛋白或多肽的編碼基因與編碼Ｍ１３噬菌體顆粒末端蛋白的基因Ⅲ構建成融合基因，將含有融合基因的重組Ｍ１３噬菌體轉染大腸桿菌，可以在噬菌體顆粒表面展示目的蛋白。（圖１８－５）18醫(yī)藥基因工程18醫(yī)藥基因工程b.人源性抗體轉基因小鼠通過構建轉基因小鼠，可使小鼠產(chǎn)生人源性單克隆抗體。用人的抗體基因轉入小鼠并替代小鼠的相應基因，產(chǎn)生能分泌人抗體的轉基因小鼠，第一個獲得的人源性抗體是抗破傷風類毒素的單克隆抗體。在轉基因小鼠基礎上，建立了一種產(chǎn)生人抗體的小鼠模型ＸenoＭouse。將小鼠的全套抗體基因敲除掉，同時將人的大部分輕鏈和重鏈基因插入到小鼠的染色體中，當用抗原刺激小鼠時就可產(chǎn)生人源性抗體。利用該模型已制備了多種類型的人單克隆抗體，如抗人表皮生長因子受體的人源性抗體。18醫(yī)藥基因工程５.基因工程抗體的產(chǎn)生⑴大腸桿菌表達系統(tǒng)⑵酵母表達系統(tǒng)⑶哺乳動物表達系統(tǒng)⑷植物表達系統(tǒng)⑸昆蟲表達系統(tǒng)18醫(yī)藥基因工程第四節(jié)核酸類藥物18醫(yī)藥基因工程一.反義核酸藥物反義核酸是一些人工合成的單鏈反義分子，可以通過堿基互補原則與被感染細胞內(nèi)的某個靶標mＲＮＡ或ＤＮＡ結合，抑制或封閉該基因的轉錄和表達，或切割mＲＮＡ使其喪失功能。反義核酸作為藥物可以治療正常蛋白超量表達的疾病，如癌癥，炎癥，病毒或寄生蟲感染。根據(jù)組成的特點可將其分為反義ＲＮＡ，反義ＤＮＡ，肽核酸和核酶。18醫(yī)藥基因工程１.反義ＲＮＡ機理：利用反義ＲＮＡ可以與mＲＮＡ結合形成互補雙鏈，阻斷核酸蛋白體同mＲＮＡ的結合，從而抑制了mＲＮＡ翻譯成蛋白質(zhì)的過程。反義ＲＮＡ在細胞核中與mＲＮＡ結合后會干擾其加工和剪切，如加帽和加poly（Ａ）尾，還會干擾mＲＮＡ轉運至細胞質(zhì)。反義核酸和mＲＮＡ結合后還使得mＲＮＡ更加易被核酸識別而降解，從而大大縮短mＲＮＡ的半衰期。反義ＲＮＡ除了可以影響基因的表達外，還可與引物ＲＮＡ前體互補結合，從而抑制ＤＮＡ復制。反義ＲＮＡ可以人工合成，更多的是將目的ＤＮＡ以反方向插入載體通過反義表達載體產(chǎn)生。通過這些載體可用于研發(fā)新型，高特異性和高效的反義治療藥物，在治療艾滋病和麻疹以及惡性腫瘤方面起到了一定作用。18醫(yī)藥基因工程２.反義ＤＮＡ反義ＤＮＡ的定義：也稱反義寡核苷酸或反義脫氧核苷酸，是一種人工合成的，能與mＲＮＡ互補的，用于抑制翻譯的短小反義核酸分子。反義ＤＮＡ與mＲＮＡ結合后還可以誘導ＲＮaseＨ的產(chǎn)生，降解ＤＮＡ－ＲＮＡ復合物中的ＲＮＡ，從而大大縮短了mＲＮＡ的半衰期。反義ＲＮＡ可以通過自動合成儀，但其很易被降解，為提高其穩(wěn)定性，親和力，降解靶核酸的能力以及其他性能，由此催生了第一代反義核酸藥物硫代磷酸脫氧寡核苷酸（ＰＳ－ＯＤＮ）。第一個反義核酸藥物福米韋生就是ＰＳ－ＯＤＮ藥物，由２１個硫代磷酸脫氧核苷酸組成，核苷酸序列為５‘－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３’，具有強大的抗病毒作用。18醫(yī)藥基因工程３.肽核酸肽核酸是以肽鏈骨架代替核糖－磷酸骨架的ＤＮＡ類似物，是通過計算機模擬設計出來的新核酸類似物。以２－氨基乙基甘氨酸為骨架，４種堿基為側鏈，堿基通過亞甲碳基與骨架相連，保持與天然核酸中相鄰堿基以及堿基與骨架間相近的鍵數(shù)目，相鄰堿基間間隔６個鍵，堿基與骨架間為２～３個鍵。肽核酸保留了與互補ＤＮＡ或ＲＮＡ雜交的性能，親和力得到進一步提高，同時，其化學和生物學穩(wěn)定性更強，不易被核酸酶和蛋白酶降解；從化學角度看，更易進行大規(guī)模生產(chǎn)。18醫(yī)藥基因工程４.核酶核酶是一類具有催化活性的ＲＮＡ分子，具有核苷酸水解活性,可特異性剪切ＲＮＡ分子，相當于ＲＮＡ酶。核酶可以調(diào)節(jié)基因的表達，在ＲＮＡ的自我裂解，自我剪切，tＲＮＡ的轉錄后加工等過程中起重要作用。可用于藥物的開發(fā)，抑制特定基因的表達。核酶具有特定的催化域和底物結合域。底物結合域可通過堿基互補與靶序列結合，相當于反義ＲＮＡ；而催化域可在特定位點剪切目的ＲＮＡ。通過改變結合域的序列，核酶可切割特定序列的mＲＮＡ。核酶用作藥物的一個優(yōu)點是不易引起動物或人的免疫反應。具有催化活性的脫氧核酶（ＤＮＡzyme），是通過合成隨機寡核苷酸庫，從中篩選到一個具有核酶活性的寡核苷酸。該寡核苷酸含一個由１５個核苷酸組成的催化域，兩側是７～８個核苷酸的臂，與目標ＲＮＡ互補配對。針對不同目的基因的脫氧核酶已經(jīng)在體外和體內(nèi)發(fā)生了酶學反應。18醫(yī)藥基因工程二.核酸疫苗１.核酸疫苗的工作方式核酸疫苗又稱基因疫苗或ＤＮＡ疫苗，是利用基因重組技術將編碼抗原的基因裝入載體，然后直接導入動物體內(nèi)，通過機體細胞的轉錄系統(tǒng)合成蛋白，產(chǎn)生的蛋白作為抗原誘導免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答，即通過細胞和體液免疫反應產(chǎn)生抗體，從而達到預防和治療疾病的目的。２.疫苗載體核酸疫苗是通過疫苗載體將抗原編碼基因?qū)霗C體而激發(fā)免疫的。導入方式有⑴裸ＤＮＡ直接注射到肌肉內(nèi)；⑵用脂質(zhì)體包裹ＤＮＡ后在注射；⑶將ＤＮＡ用基因槍注入體內(nèi)；⑷通過去毒的內(nèi)生細菌引導ＤＮＡ進入體內(nèi)。疫苗載體是一種穿梭質(zhì)粒載體，含有真核表達系統(tǒng)的啟動子，以及用于真核細胞的選擇標記；用于動物實驗的載體還含有在哺乳動物細胞中復制的病毒復制區(qū)；為提高疫苗的免疫原性，載體中還加入具有強烈佐劑作用的ＣＧ序列。典型的核酸疫苗載體有pcＤＮＡ３.１，以及在此基礎上去掉病毒復制單位并用于雙宿主可用的卡那霉素抗性基因替換氨芐青霉素抗性基因和新霉素抗體基因的改建載體pＶＡＸ１。（圖１８－６）

18醫(yī)藥基因工程３.核酸疫苗的特點優(yōu)點：⑴安全性好，沒有感染的危險；⑵免疫效果好，核酸疫苗能在自身細胞中產(chǎn)生于自然抗原接近的外源性蛋白，能誘導產(chǎn)生類似自然抗原的免疫應答；⑶制備簡單，只需對編碼抗原的基因進行克??；⑷核酸疫苗的本質(zhì)是核酸分子，因而不同于蛋白質(zhì)和活疫苗，可以在室溫條件下保存，不存在疫苗的冷藏和低溫運輸問題，從而保證ＤＮＡ疫苗的高效接種率；⑸免疫應答持久，外源基因的不斷表達可持續(xù)提供抗原。18醫(yī)藥基因工程三.ＲＮＡ干擾１.ＲＮＡ干擾現(xiàn)象

ＲＡＮ干擾（ＲＮＡi）是指對應于某種mＲＮＡ的正義ＲＮＡ和反義ＲＮＡ組成的雙鏈ＲＮＡ（dsＲＮＡ）分子使mＲＮＡ發(fā)生特異性降解，導致其不能表達的轉錄后基因沉默（ＰＴＧＳ）現(xiàn)象。

ＲＮＡi發(fā)揮作用包括兩個階段：

⑴起始階段：雙鏈ＲＮＡ分子進入細胞后被稱為Ｄicer的核酸酶切割為２１～２３個核苷酸長的小分子干擾ＲＮＡ片段（siＲＮＡ）。Ｄicer核酸酶屬于ＲＮaseⅢ家族，能夠特異識別雙鏈ＲＮＡ，產(chǎn)生的小片段ＲＮＡ的３‘端都有２個突出堿基。然后雙鏈siＲＡＮ與核酸酶結合形成ＲＮＡ誘導沉默復合體（ＲＩＳＣ）。⑵效應階段：siＲＡＮ打開雙鏈從而激活ＲＩＳＣ，激活的ＲＩＳＣ通過堿基配對與對應的mＲＮＡ結合，并在距離siＲＡＮ３’端１２個堿基的位置切割mＲＮＡ。同時，siＲＡＮ可作為引物并以mＲＡＮ為摸板合成新的dsＲＮＡ；這樣又進入上述循環(huán)，繼續(xù)對