分子生物學(xué)常用技術(shù)課件

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳

分子雜交技術(shù)PCR技術(shù)DNA物理圖譜

DNA序列測定生物芯片“基因靶向”技術(shù)RNA干擾技術(shù)1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRPCR內(nèi)容包括:PCR技術(shù)的發(fā)明PCR擴增產(chǎn)物的分析PCR技術(shù)基本原理

PCR條件優(yōu)化PCR反應(yīng)體系

PCR技術(shù)的發(fā)展史PCR反應(yīng)條件PCR技術(shù)的應(yīng)用(請自學(xué))1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRPCR技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)

體外核酸擴增技術(shù)將目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)體外擴增至百萬倍,千萬倍。

PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域:革命性創(chuàng)舉和里程碑。

迅速滲透到各個領(lǐng)域:分子克隆、目的基礎(chǔ)檢測、基因診斷、基因表達調(diào)控,、

法醫(yī)學(xué)鑒定、食品衛(wèi)生,、環(huán)境監(jiān)測考古學(xué)等。

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR

簡便、特異、快速、靈敏、產(chǎn)率高、重復(fù)性好、易自動化等可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定，用PCR幾小時便可完成。。DNA克隆重組,PCR,DNA序列分析構(gòu)成了整個分子生物學(xué)實驗工作的基礎(chǔ)。PCR特點:1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRRT-PCRRAPD-PCRRandomAmplificationofPolymorphicDNA.DDRT-PCR差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCRLAM-PCRLM-PCRInversePCRNestedPCRReal-timePCRRACEMultiplexPCRAnchoredPCRImmunoPCRAsymmetricPCRLP-PCRRecombinantPCRSSCPInsituPCRFlowchipPCRPCR相關(guān)技術(shù)層出不窮請自學(xué)1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR(一):PCR技術(shù)的發(fā)明

1971年:

Korana設(shè)想

本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想：

“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR1983年:KaryB.Mullis(1944-)

在Cetus公司工作期間，他原本是要合成DNA引物來進行測序工作，常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。一天晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個引物去擴增模板DNA的想法…...Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合DNA，……1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR1985年:MullisPCR設(shè)想的實現(xiàn)

原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供:摸板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合適的緩沖體系、DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。

Mullis使用是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段.

缺點是：1):Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。2):特異性差:引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進行，模板和引物之間的堿基錯配，合成的DNA片段不均一。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR1988年:Keohanog

改用T4DNA聚合酶進行PCR，擴增的DNA片段均一，特異性高。但不耐高溫,每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等:從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶:耐高溫，93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃2h后殘留活性:40%.1):不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶;2):大大提高了特異性,擴增效率和靈敏性，增加了擴增長度(2.0Kb)。

此酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。

TaqDNA多聚酶的發(fā)現(xiàn)使PCR得以廣泛應(yīng)用。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR1993年:Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學(xué)獎，他所取得的成就是發(fā)明了PCR技術(shù)。1998-1999年:Bill

Clinton

唯一一個在全美國人面前就自己的性丑聞事件道歉的美國總統(tǒng),因為1):有了PCR技術(shù),2):不懂PCR技術(shù)。1998年，美國總統(tǒng)比爾·克林頓曾當眾宣稱，他與白宮實習(xí)生萊溫斯基“沒有發(fā)生任何性關(guān)系”，但萊溫斯基隨后出示了一條沾有克林頓精液的藍裙子。8個月后，克林頓不得不被迫承認錯誤

一樣的PCR、一樣的美國人1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR(二):PCR技術(shù)基本原理

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

1):模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右后，雙鏈DNA變性為單鏈DNA；2):模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；3):引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將目的基因擴增放大幾百萬倍。

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR

PCR的反應(yīng)動力學(xué)

PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。最終的DNA擴增量可用下列公式計算Y＝(1＋X)n

Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR

產(chǎn)物持續(xù)增加直到平臺期

TheoreticalincreaseLogTargetDNACycle#RealityY＝(1＋X)n反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期(Plateau).(引物、dNTP反應(yīng)原料消耗、PCR擴增效率及DNA聚合酶種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素)。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRPCR擴增產(chǎn)物

長片段產(chǎn)物短片段產(chǎn)物

長片段產(chǎn)物和短片段產(chǎn)物是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是向3'端開始延伸，其5'端是固定的，3'端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。

進入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。

短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段。

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR“短產(chǎn)物片段”按指數(shù)倍數(shù)增加“長產(chǎn)物片段”以算術(shù)倍數(shù)增加（原始模板拷貝X循環(huán)次數(shù)，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。Y＝(1＋X)n1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRPCR原理演示:1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR(三):PCR反應(yīng)體系標準的PCR反應(yīng)體系：

Totalvolume100ul(20-100ul)10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR

PCR反應(yīng)五要素：

引物、Taq酶、dNTP、模板、Mg2+1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR1:引物：

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵

PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增.引物量：每條引物的濃度10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配,非特異性擴增和二聚體的機會。

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR

設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

1):引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2):PCR產(chǎn)物：200-500bp，可擴增長至30kb的片段。

3):引物堿基：G+C含量以40-60%，G+C太少擴增效果不佳，

G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免4個單一堿基的連續(xù)出現(xiàn)。

4):避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3‘端的互補，否則會形成引物二聚體。

3’5’3’5’3’5’3’5’StableInteractionAmplificationPrimerDimers1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR5):引物3’端的堿基應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

6):引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性.

7):引物5’端加上合適的酶切位點，這對被擴增的靶序列的酶切分析或分子克隆很有好處。在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們

8):使用兼并引物時,要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3‘端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)9):最好學(xué)會使用一種designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar,VectorNTI,Online

desginetal.

設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則續(xù)：1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR2:酶及其濃度

兩種TaqDNA聚合酶:

1):一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶2):基因工程酶

催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量:2.5U(總反應(yīng)體積為100ul)

濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR3:dNTP的質(zhì)量與濃度

dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。用1MTris.HCL的緩沖液7.0～7.5配成高濃度后，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。

在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，4種dNTP的濃度要相等，如其中任何一種濃度偏高或偏低，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR4:模板核酸

DNA粗制品及總RNA均可作為擴增模板模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。

RNA模板提取一般采用Kit提取，要防止RNase降解RNA，。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR5:Mg2+濃度

Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增。

Mg2+濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR(四):PCR反應(yīng)條件:溫度(變性-退火-延伸)時間(變性-退火-延伸)循環(huán)次數(shù)1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR

1:變性溫度與時間：

94℃30-60sec

變性溫度低，解鏈不完全。

一般情況下，93℃～94℃1min足以使模板DNA變性溫度過高，高溫環(huán)境對酶的活性有影響。

不完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR2:退火溫度與時間：40℃～60℃30～60sec退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR3:延伸溫度與時間：常用溫度為72℃TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

PCR反應(yīng)的延伸常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR4:循環(huán)次數(shù):

25～40次

循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。模板DNA少,酶質(zhì)量活性差,適當增加循環(huán)次數(shù).一般的循環(huán)次數(shù)選在25～40次之間，

循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR(五):PCR擴增產(chǎn)物的分析

PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增，其結(jié)果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定。

1.凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致。

2.酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶切、獲得符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，還能進行變異性研究。

3.分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

4.核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR(六):PCR條件優(yōu)化1:理想的primers:特異地與目的序列兩側(cè)的單一DNA序列而非其他DNA序列退火的引物2:優(yōu)化反應(yīng)試劑濃度:a):Mg離子的作用主要是

dNTP-Mg與核酸骨架相互作用并能影響Polymerase的活性，一般的情況下

Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整，調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度;1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRb):NH4+K+都會影響PCR，增加K+的濃度后,會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的嚴謹性(stringency)，NH4+也有相同的作用;

c):polymerase：不同公司的酶質(zhì)量活性有所不同,需要自己摸索適合的酶的濃度;

d):template

50ulPCRSYSTEM

======================

humanDNA0.1ug-1ug

E.Coli10ng-100ng

LamadaDNA0.5ng-5ng

PlasmidDNA0.1ng-10ng

======================1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR3:溫度:

a.denaturation

常規(guī)是先94度變性5分鐘,GCRich的摸板是95度5分鐘

;然后94度30-60S.

b.annealing

重點：一般情況下,是從Tm-5C度根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進行調(diào)整.有條件的可以做gradientpcr.退火的時間在30-60S,時間短一些可以得到更好的效果.因為,polymerase在

annealingtemp.時也會有一些活性.所以在annealing的時間過長,會極大的增加非特異性擴增，如從gDNA里擴增大片段,還可使用twostepPCR.1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR4:touchdownPCR

原理很簡單,連續(xù)降低annealingtemp從Tm+5-Tm-10度C。ANNEALINGTEMP.55度

945min9430s6030s721min2cycles9430s5930s721min2cycles9430s5830s721min2cycles9430s5130s721min2cycles9430s5030s721min20cycles725min1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR5:hotstartPCR

熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。

TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。

hotstartpolymerase激活：94度10-15min1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是:a):在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性.

b):在反應(yīng)體系達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法過于煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用，并容易造成污染。c):其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。d):hotstartpolymerase94度10-15min1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR6:BoosterPCR(<美俚>熱心的擁護者,后推的人,支持者,后援者,調(diào)壓器)

開始幾個cycles保持primer的低濃度1ughumangenomicDNA大約在3X100,000個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合.

當模板的濃度過低,比如低于100個分子時,引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng).引物容易自身進行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molarratio在10,000,000~100,000,000:1.以確保開始擴增的準確性.然后boostePrimer的濃度到正常的水平1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR7:循環(huán)數(shù)和長度

確定循環(huán)數(shù)的基本原理是:產(chǎn)物能夠保證你進一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).

產(chǎn)物的量不夠,優(yōu)化的方法有:

1):增加TEMPLATE

2):增加循環(huán)數(shù)

如何確定循環(huán)數(shù)：做一個PCR體系,40循環(huán),50ul,分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)

另一個會影響PCR特異性的是PCRcycling時在兩個溫度間變化的速率(rampingrate).當然是越高越好.1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR8:thermalcycler

PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長時間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).9:PCR增強劑

enhancer實在是多種多樣.基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配,增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量:dimethylsulfoxide(DMSO)upto10%,formamideat5%,trimethylammoniumchloride10-100uM,detergentssuchasTween200.1-2.5%,polyethyleneglycol(PEG)60005-15%，glycerol10-15%,singlestrandedDNAbindingproteins，Gene32protein1nM,E.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM，7deaza-dGTP(forGCrich)150uMwith50uMdGTP,TaqExtender(stratagene)，PerfectMatchPCREnhancer(stratagene),Q-solution(Qiagen)

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR10:TemplateDNApreparation

提取DNA時的試劑會抑制PCR反應(yīng)的順利進行.因此需要對TEMPLATEDNA進行純化.特別是SDS(<0.01%)的情況下就能強烈抑制PCR的進行.可以加入一些nonionic試劑,如Tween,Nonid,Trition之類的反過來抑制SDS.還有proteinaseK也要除干凈,不然會降解polymerase.11:NestedPCR

簡單點說設(shè)計兩對引物,一對是長的,一對是包含在長引物內(nèi)的,用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量.而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRLaboratoryTechniqueUseCleanBench(Hood)UseNucleasefreetubesUseAerosolResistantTipsUseCalibratedMicropipettorUseLargeVolumes(5uLandup)PipetteIntoEachReactionVesselOnlyOnce1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR(七):PCR儀技術(shù)的發(fā)展史聚合酶鏈式反應(yīng)自從1993年到現(xiàn)在很快經(jīng)歷了四代產(chǎn)品：

第一代：手動/機械手式水浴基因擴增

用三個恒溫水浴箱，分別將三個水浴溫度恒定在三個溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復(fù)性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）。用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴，標本在每個水浴箱中恒溫的時間用秒表計時。

特點是：勞動強度大，容易因疲勞引起差錯；而優(yōu)點是:設(shè)備簡單，它無須升降溫過程，實驗時間短，液體污染等。

機械手裝置，替代上述手工移動標本過程，形成了機械手水浴式基因擴增儀，該改進解決了實驗人員的高強度勞動問題，但又帶來了一個機械手部件大行程頻繁相對運動而引起的高故障。

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR

第二代：自動化控制型定性基因擴增儀

也有人稱該種擴增儀為干式基因擴增儀，它是最具代表性的擴增儀，包括后續(xù)介紹的第三代、第四代都是以第二代為基礎(chǔ)集成了定量檢測部分。第二代的定性PCR只能判斷陰性陽性，而無法評價特定核酸的濃度及定量分析

第三代：終點定量/半定量

自從1996年美國ABI公司發(fā)明第一臺熒光定量PCR儀以來，PCR技術(shù)和應(yīng)用從定性向定量快速發(fā)展.終點定量PCR的優(yōu)點是設(shè)備投資少。終點定量PCR技術(shù)是從定性向?qū)崟r定量過渡的一個中間產(chǎn)品.1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR第三代：終點定量/半定量(Terminaldetection）

終點檢測法就是PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后，對其產(chǎn)物進行分析和定量檢測的一種方法。為了實現(xiàn)對PCR終產(chǎn)物的定量檢測，必須對PCR產(chǎn)物進行預(yù)先標志。目前標志物有：放射性同位素和非放射性標志物。后者包括螺旋結(jié)構(gòu)染料（如溴化乙錠等）、地高辛、生物素以及熒光素（包括普通熒光素如Fam、TRAMA和鑭系螯合物等），地高辛、生物素以及熒光素可以通過標志dNTP或引物的5’端從而摻入PCR擴增產(chǎn)物中，除熒光素標志產(chǎn)物可直接發(fā)光外，其余可與HRP或AKP標志的抗地高辛抗體或親和素反應(yīng)，加入底物后產(chǎn)生顏色、發(fā)光或熒光信號，從而進行檢測。這些標志物進行標志的是檢測時的捕獲劑或是作為定量檢測的指示劑.終點法檢測要特別注意“平臺效應(yīng)”對實驗結(jié)果的影響

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR第四代：實時定量PCR(real-timePCR)

實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。

實時熒光定量檢測系統(tǒng)：

PCR儀＋實時熒光定量試劑+電腦+自動分析軟件，。

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR常規(guī)PCR常規(guī)PCR基于產(chǎn)物擴增終點分析凝膠電泳分析5’TemplateCycle15’2XTemplate4XTemplate30-40cyclesCycle25’5’5’5’對目的基因的有無進行定性分析1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR普通PCR和定量PCR的區(qū)別適用定性分析，不適合定量分析；PCR產(chǎn)物的長度從100bp－數(shù)kb實時檢測:每個循環(huán)都產(chǎn)出熒光信號絕對定量，靈敏度更高PCR產(chǎn)物的長度一般在60-150bps1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR產(chǎn)物持續(xù)增加直到平臺期Real-timePCR在指數(shù)期線性范圍內(nèi)進行熒光檢測.TheoreticalincreaseLogTargetDNACycle#Reality沒有任何儀器可以檢測到初始循環(huán)中非常低的產(chǎn)物熒光，只能檢測到背景熒光水平。PCR:Theoryvs.Reality產(chǎn)物量n=(初始模板量)2n

(n=循環(huán)數(shù))1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRWhyareendpointmeasurementssodifferent?AllPCRsreachaplateauphaseeventually.toomuchproduct,enzymeexhaustion,dNTPsrunoutetc…

Considertheexample.Ifyoustoppedafter40cycles,youcouldnotdifferentiatea1000folddifferenceinstartingmaterial!Thereforemeasuringatsomearbitraryendofcyclingcannotconclusivelyidentifytheoriginalamountofmaterial1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR實時熒光定量PCR原理

所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念

--Ct閾限循環(huán)值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：

每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖所示）。1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRWhatisThresholdCycle(CT)?CTForanyquantitativemeasurement:

establishabaselinetoidentifyavalueofnosignificantactivityintheexperimentalparameters.Setthreshold:isanamountoverthebaselinethatindicatesactionintheexperiment.Itshouldbehigherthanthebaselinetoensurethatnormal‘drift’ofthebaselineisexcluded.Itshouldbecloseenoughtothebaselinetodetectthefirstsignificantchangeinyourdata.

TheThresholdCycle(CT)isthecycleoftheamplificationreactioninwhichthesamplefluorescencesignalrisesabovethethresholdvalue.

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR2.熒光域值（threshold）的設(shè)定

反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍.3.Ct值與起始模板的關(guān)系

研究表明：每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR初始模板量相差10倍，Ct值相差3.32個循環(huán).1X1061X1051X104

1X103

1X10217.09±0.0420.10±0.0623.41±0.0526.68±0.0530.26±0.26(Template0)2n=(Template0)10n=3.32Input C(t) C(t)Analysis初始模板濃度相差2倍，Ct值相差1個循環(huán)產(chǎn)物量n=(初始模板量)2n

(n=循環(huán)數(shù))1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRC(t)Analysis初始模板量的對數(shù)與Ct值之間存在反比線性關(guān)系較高的初始模板濃度有較低的C(t).1X1061X1051X104

1X103

1X102Input1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRThresholdCycle,Ct,isareliableindicatorofinitialcopynumberR=0.998821分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR核酸染料技術(shù)

代表：SYBRGreenI(SGI)

熒光探針技術(shù)

代表：TaqManprobe

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR

SYBRGreenI與dsDNA結(jié)合SGI與dsDNA結(jié)合后受激發(fā)熒光強度增加1000倍.Real-TimeChemistry:SYBRGreenISYBl5`3`5`3`SYBSYBSYBlll1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRReal-TimeChemistry:SYBRGreenI5’TemplateCycle15’2XTemplate4XTemplate30-40cyclesCycle25’5’5’5’SYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYBSYB1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR優(yōu)點

僅需要一對引物，實驗設(shè)計簡單。PCR擴增后可進行產(chǎn)物的熔解曲線分析，以確定特異性。

實驗成本低。

不足

特異性僅由引物保證。非特異性雙鏈DNA也會產(chǎn)生熒光信號。

不能用于多重Real-TimePCR。SYBR

Green

1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRHOWISREALTIMEDONE?TaqmanprobeFromPerkin-Elmer/ABIAhybridizationprobeisconstructedwithafluorescentreporteratoneendtoanearbyquencher.

Thereporterisexcitedbutitsemittedfluorescenceiscapturedbythenearbyquencher.Noreporterfluorescenceisdetected.FluorescentTagTargetSequenceReporterQuencherDuringtheextensionstep,thepolymeraseencounterstheTaqManprobeandchewsofftheend.

ONCEFREEDFROMTHEQUENCHER,THEREPORTERFLUORESCENCEISDETECTED,INDICATINGTARGETAMPLIFICATION.TaqPolymerase1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR探針退火溫度應(yīng)比引物高5～10℃一般情況下探針長度小于30bp5末端不能是G，G可能會淬滅熒光選擇GC含量在30～80％的目標序列設(shè)探針，將探針置于G和C含量高的區(qū)域引物盡量靠近探針ProbeDesign

TaqManprobe：先合成引物，用SYBRGreenI進行篩選，確定引物特性后再合成探針！1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR優(yōu)點特異性好由引物和探針雙重保證。非特異性雙鏈DNA不會產(chǎn)生熒光信號?？蛇\行用于多重Real-TimePCR。不足

需要設(shè)計引物和探針

實驗成本高。

TaqManprobe：1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRReal-TimePCR

dataanalysis絕對定量——標準曲線法

—預(yù)知標準樣品的濃度（ng/uL©/uL&……）.

—10×梯度稀釋標準樣品.

—未知樣品和標準樣品同時擴增.1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRStandardControlUnknowSample1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRReal-TimePCR

dataanalysis相對定量腫瘤組織(Test)正常組織(Calibrator)目的基因Target目的基因Target參考基因Reference參考基因Reference1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRReal-TimePCR

dataanalysisTestCalibratorTargetgeneCt(target,test)Ct(target,cal)ReferencegeneCt(ref,test)Ct(ref,cal)比較ΔCt法——引入數(shù)學(xué)公式來計算相對數(shù)量

—2ΔCt法

—2ΔΔCt法

—Pfaffl法結(jié)果為相對于校正樣本表達水平的比值1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRReal-TimePCRTheory樣品A樣品BEfficiency=[10(-1/slope)-1]×100％標準曲線的斜率與PCR反應(yīng)效率直接相關(guān)1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCRPrimerandAmpliconDesign引物GC含量在50～60％引物Tm在50～65℃引物的位置避開目標序列上的二級結(jié)構(gòu)避免G或C重復(fù)3次將G或C置于引物末端’引物和擴增子：1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR6.避免引物3末端互補7.避免二級結(jié)構(gòu)8.在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對,確保特異性9.產(chǎn)物長度在75～200bp之間10.產(chǎn)物避免二級結(jié)構(gòu)11.產(chǎn)物避免有多于4個的單個堿基重復(fù)1分子生物學(xué)常用技術(shù)3PCR熔解曲線分析樣品溫度升高，dsDNA變性釋放出SGI，使得體系中熒光信號減弱。

溫度到