生乳及巴氏殺菌乳中嗜冷菌的測定快速培養(yǎng)法

1生乳及巴氏殺菌乳中嗜冷菌的測定快速培養(yǎng)法本文件描述了生乳及巴氏殺菌乳中嗜冷菌測定的快速培養(yǎng)法。本文件適用于生乳及巴氏殺菌乳中嗜冷菌的快速測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1GB/T66823術(shù)語和定義食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗總則分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理試樣懸浮液與44℃-47℃的乳平板計數(shù)（MPC）瓊脂于平板中混合，于21℃條件下培養(yǎng)25h，菌落計數(shù)，算出每mL（g）檢樣中的嗜冷菌數(shù)量。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.1水：GB/T6682，一級。5.2無菌磷酸鹽緩沖液儲備液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1000mL后，4℃貯存。25.3無菌磷酸鹽緩沖液工作液：取磷酸鹽緩沖液儲備液（5.2）1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。5.4無菌生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。5.5MPC瓊脂：稱取5.0g酪蛋白胨、2.5g酵母提取物、1.0g無水葡萄糖和1.0g不含抑制性物質(zhì)的脫脂奶粉溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.1。加入9.0~18.0g瓊脂1，煮沸溶解，分裝于適宜容器，密封后，121℃高壓滅菌15min。6儀器設(shè)備6.1恒溫培養(yǎng)箱：溫度為21℃±1℃。6.2高壓滅菌鍋。6.3培養(yǎng)皿：直徑90mm。6.4pH計：25℃時精度為±0.1。6.5移液器：0.1mL和1mL，配無菌槍頭。6.6天平：精度為±0.1g。6.7水浴鍋。6.8振蕩器。6.9均質(zhì)器。6.10菌落計數(shù)裝置（可選例如，由帶黑暗背景的發(fā)光基座、裝有輔助菌落數(shù)檢測的放大鏡和（可選）機(jī)械或電子式數(shù)字計數(shù)器組成。7樣品樣品的采集按GB4789.1執(zhí)行。8檢驗程序嗜冷菌的快速檢驗程序見圖1。1）基于瓊脂的凝膠程度。3圖1嗜冷菌快速檢驗程序9試驗步驟9.1取25mL（g）樣品置于盛有225mL無菌磷酸鹽緩沖液（5.3）或無菌生理鹽水（5.4）的無菌錐形瓶或無菌均質(zhì)袋中，混勻，制成1:10的樣品勻液。9.2用1mL移液器（6.5）吸取樣品勻液（9.1）1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意槍頭尖端不應(yīng)觸及稀釋液面），振蕩混勻，制成1:100的樣品勻液。9.3按9.2操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每次稀釋均使用新的無菌槍頭。9.4選擇適宜稀釋度的樣品勻液（至少2個連續(xù)稀釋度），取1mL樣品勻液于培養(yǎng)皿（6.3）內(nèi)，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個培養(yǎng)皿（6.3）內(nèi)作空白對照。49.5將12mL~15mL冷卻至44℃~47℃的MPC瓊脂（5.5）傾注培養(yǎng)皿，從初始懸浮液制備結(jié)束到將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿（6.3）之間的時間不應(yīng)超過45min。轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使樣品勻液與培養(yǎng)基均勻混合，冷9.6待瓊脂凝固后，將培養(yǎng)皿（9.5）倒置，21℃±1℃培養(yǎng)25h±1h。10菌落計數(shù)10.1可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)裝置（6.10），記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（ColonyFormUnit,CFU）表示。10.2選取菌落數(shù)在10CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于10CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為“多不可計”。10.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。其中平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無較大片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的四分之一，而其余四分之三中菌落分布又很均勻，可通過推算，以代表一個平板的菌落數(shù)。11試驗數(shù)據(jù)處理結(jié)果計算11.1若只有1個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每mL（g）試樣中嗜冷菌計數(shù)結(jié)果。11.2若有兩個及以上連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按下列公式計算：試樣中嗜冷菌數(shù)量以N計，單位為菌落形成單位每毫升（克）[CFU/mL（g）]，按式（1）計算。式中：ΣC——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和，單位為菌落形成單位（CFUn1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d——第一稀釋度稀釋因子。12結(jié)果報告512.1若所有稀釋度培養(yǎng)皿中菌落數(shù)均少于10CFU，結(jié)果報告為“樣品中嗜冷菌計數(shù)小于10×1/dCFU/mL（g）,式中d為最低稀釋液的稀釋度。12.2若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。12.3嗜冷菌計數(shù)小于100CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。12.4嗜冷菌計數(shù)大于或等于100CFU時，第三位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，保留兩位有效數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，保留兩位有效數(shù)字。12.5若空白對照上有菌落生長，則此次檢驗結(jié)果無效。6結(jié)構(gòu)編號對照一覽表和技術(shù)差異及其原因一覽表結(jié)構(gòu)編號對照一覽表見表A.1,技術(shù)差異及其原因一覽表見表A.2。表A.1本文件與ISO17410:2019結(jié)構(gòu)編號對照一覽表本文件結(jié)構(gòu)編號ISO17410:2019結(jié)構(gòu)編號1AnnexBB.122334455-5.2-5.3-5.4AnnexAA.3.1666.36.26.46.36.56.46.66.56.86.6-6.76.106.8-6.9-6.10778-9AnnexBB.39.2AnnexBB.3.2.1、B.3.2.29.3AnnexBB.3.2.39.4AnnexBB.3.2.49.5AnnexBB.3.2.5、B.3.2.69.6AnnexBB.3.2.79.39.3.1、AnnexBB.3.1-9.3.2-------表A.2本文件與ISO17410:2019技術(shù)差異及其原因的一覽表本文件結(jié)構(gòu)編號技術(shù)差異原因2規(guī)范性引用文件更改為中國國家標(biāo)準(zhǔn)ISO17410:2019引用ISO標(biāo)準(zhǔn)為規(guī)范性引用文件，本文件更改為中國國家標(biāo)準(zhǔn)8刪除嗜冷微生物定義本文件僅進(jìn)行嗜冷菌檢測增加無菌磷酸鹽緩沖液儲備液的配制方法增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用5.2增加無菌磷酸鹽緩沖液工作液的配制方法增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用5.3增加無菌生理鹽水的配制方法增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用5.4增加天平增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用6.6增加振蕩器增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用6.8增加均質(zhì)器增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用7明確樣品采集的要求增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用8增加檢驗程序的說明增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用9.4增加空白對照增加