2020版脊髓性肌萎縮癥遺傳學診斷專家共識(全文)

2020版：脊髓性肌萎縮癥遺傳學診斷專家共識（全文）脊髓性肌萎縮癥（spinalmuscularatrophy，SMA）是兒童最常見的神經肌肉病，以脊髓前角α-運動神經元退化變性導致的肌無力和肌萎縮為主要臨床特征。本共識中SMA特指位于5q13的運動神經元存活基因1（SMN1；OMIM600354）致病性變異所導致的5q-SMA。SMA發(fā)病率約為1/10000，人群攜帶率約為1/50[\t"/CN112137202040/_blank"1]。2019年中國大陸上市了疾病修正治療藥物諾西那生鈉注射液，也相繼發(fā)表了SMA多學科管理專家共識[\t"/CN112137202040/_blank"2]，標志著SMA在我國進入了一個全新的精準診治和管理時期。SMA的攜帶者和新生兒篩查在一些國家和地區(qū)已常規(guī)開展[\t"/CN112137202040/_blank"3,\t"/CN112137202040/_blank"4]，我國一些地區(qū)也逐漸開始篩查[\t"/CN112137202040/_blank"5,\t"/CN112137202040/_blank"6]，SMA預防窗口進一步提前。SMA的致病基因SMN1和修飾基因SMN2（OMIM601627）高度同源，SMN1決定疾病的發(fā)生，SMN2影響疾病的嚴重程度和進展，使得SMA的遺傳學診斷不同于絕大多數(shù)單基因遺傳病。規(guī)范SMA遺傳學診斷及應用對于臨床診治、管理、預防和遺傳咨詢將提供重要幫助。本共識參照國內外近年SMA臨床診療實踐和指南共識[\t"/CN112137202040/_blank"2,\t"/CN112137202040/_blank"7,\t"/CN112137202040/_blank"8,\t"/CN112137202040/_blank"9,\t"/CN112137202040/_blank"10]，由具有實踐經驗的多學科專家研究起草，包括了患者和攜帶者基因型、基因診斷技術的適用性和局限性，以及基因診斷、產前診斷、植入前遺傳學檢測和攜帶者篩查的要點及遺傳咨詢等內容，并對SMN2拷貝數(shù)的臨床價值提出了一些建議。旨在為醫(yī)生和實驗室人員的臨床實踐提供指導幫助。臨床表現(xiàn)與分型SMA患者起病年齡差異性大，從出生前至成人期均可發(fā)病。主要表現(xiàn)為以四肢近端為主的進行性肌無力和肌萎縮，隨著疾病進展，可出現(xiàn)呼吸、消化、骨骼等多系統(tǒng)受累。根據(jù)起病年齡、運動里程碑及病情進展程度，SMA分為五型。近年的臨床實踐趨于將每型SMA進一步分為亞型，以便更好地理解自然病程和觀察藥物療效（\t"/CN112137202040/_blank"表1）[\t"/CN112137202040/_blank"11,\t"/CN112137202040/_blank"12,\t"/CN112137202040/_blank"13]。表1脊髓性肌萎縮癥的分型和臨床表現(xiàn)診斷與鑒別診斷1．SMA一般臨床診斷過程如下：（1）臨床評估：臨床醫(yī)師根據(jù)病史查體擬診，主要臨床特點為進行性、對稱性四肢和軀干的肌無力，近端重于遠端，下肢重于上肢，有時可見舌肌纖顫、手震顫；（2）臨床檢測：包括血肌酶譜，肌酸激酶（CK）值正常或輕度升高，絕大多數(shù)患者不超過正常值的10倍，肌電圖提示神經源性損害；（3）基因檢測顯示SMN1外顯子7純合缺失或SMN1復合雜合突變，陽性結果可確診SMA；（4）基因檢測陰性結果患者需行肌電圖及肌肉活檢，幫助診斷與鑒別診斷[\t"/CN112137202040/_blank"11]（\t"/CN112137202040/_blank"圖1）。SMA的臨床分型主要依據(jù)患者起病年齡和獲得的運動里程碑，并參考SMN2拷貝數(shù)（\t"/CN112137202040/_blank"表1）。部分患者的運動里程碑獲得遲于健康個體，因此，建議對患者進行定期隨訪。圖1SMA診斷流程圖2．SMA鑒別診斷：當疑似患者的基因檢測未見SMN1雙等位基因致病變異，或癥狀不典型，或伴有非SMA臨床表現(xiàn)時，進行以肌無力為主要癥狀的其他疾病的鑒別診斷非常必要。6個月以下患兒需鑒別其他軟嬰綜合征，6~18個月患兒需鑒別嬰幼兒時期起病的神經肌肉病。成年期患者需鑒別成人期起病的神經肌肉病。因需鑒別的疾病種類繁多，常選擇二代測序技術（NGS）及其他高通量診斷技術（\t"/CN112137202040/_blank"表2）。表2SMA的鑒別診斷致病機制與遺傳學診斷基礎SMA為常染色體隱性遺傳病。致病基因SMN1（NG_008691.1）定位于5q13.2，轉錄本編號NM_000344.3，其編碼的全長SMN蛋白（NP_000335.1）在各組織細胞廣泛表達，參與剪接體蛋白復合體的組裝，是真核細胞生物生存所必需的管家蛋白[\t"/CN112137202040/_blank"14]。SMN1雙等位基因發(fā)生致病性變異通常導致SMA發(fā)生。SMA病理生理學表現(xiàn)為脊髓前角α-運動神經元退行性病變和神經肌肉接頭發(fā)育異常。一、SMN1突變基因型和變異頻率98%的SMA患者的SMN1雙等位基因變異分別遺傳自雙親，2%患者有一個等位基因發(fā)生新生變異[\t"/CN112137202040/_blank"15]。SMA突變基因型主要有兩類：95%由SMN1雙等位基因純合缺失所致，即[0+0]基因型；5%由SMN1復合雜合突變所致，即一個等位基因缺失，另一個等位基因發(fā)生微小致病性變異，為[0+1d]基因型。SMN1雙等位基因均為微小致病性變異，即[1d+1d]基因型，非常罕見，目前僅有白種人近親婚配的病例報道。SMN1缺失大部分為外顯子7合并外顯子8共同缺失，少部分僅為外顯子7缺失。由于外顯子8位于非編碼區(qū)，SMN1缺失通常指外顯子7缺失。SMN1微小致病性變異在不同種族患者中表現(xiàn)不同的變異譜系，目前國內外已報道的微小致病性變異約90種（http://www.hgmd.cf.ac.uk），中國患者已報道[\t"/CN112137202040/_blank"16,\t"/CN112137202040/_blank"17,\t"/CN112137202040/_blank"18,\t"/CN112137202040/_blank"19,\t"/CN112137202040/_blank"20,\t"/CN112137202040/_blank"21,\t"/CN112137202040/_blank"22]近30種，其中檢測頻次≥2，并經美國醫(yī)學遺傳與基因組學學會（ACMG）致病性評估[\t"/CN112137202040/_blank"23,\t"/CN112137202040/_blank"24]確認為是致病性微小變異有7種（\t"/CN112137202040/_blank"表3）。表3中國SMA較常見的微小致病性變異二、SMN2表型修飾及臨床意義SMN2全長mRNA編碼與SMN1相同的SMN蛋白。SMN2與SMN1的序列同源性>99.9%，兩者僅存在5個堿基差異，其中在第7外顯子第6位c.840的C/T，導致90%的SMN2mRNA外顯子7被選擇性剪接，僅有10%的SMN2表達全長有功能SMN蛋白[\t"/CN112137202040/_blank"25]。SMN1和SMN2均位于5q13.2，該區(qū)域存在包括SMN在內的多對同源基因導致基因組不均等的互換和基因轉換，出現(xiàn)SMN1和SMN2拷貝數(shù)的多種變化。在SMA患者中可以見到SMN1真實缺失，SMN1∶SMN2拷貝數(shù)通常為0∶2，約占中國SMA人群28%[\t"/CN112137202040/_blank"16]；還有SMN1轉換為SMN2導致的SMN1缺失和SMN2增加，或者SMN1真實缺失伴隨SMN2重復，這兩類情況SMN1∶SMN2拷貝數(shù)為0∶3或者0∶4，約占62%[\t"/CN112137202040/_blank"16]；同時，SMN1和SMN2之間還存在部分轉換，出現(xiàn)SMN1-SMN2融合基因，患者僅見SMN1外顯子7缺失，外顯子8不缺失，約占6%[\t"/CN112137202040/_blank"16]。在一般人群中正常個體的SMN1基因至少為1拷貝，而SMN2基因可以為0拷貝，絕大數(shù)個體的SMN1∶SMN2拷貝數(shù)為2∶2，但也有正常個體SMN1基因多于2拷貝。SMN2拷貝數(shù)是目前公認的SMA修飾因子，患者攜帶SMN2拷貝數(shù)越多表型越輕，盡管其與表型的相關性不完全一致，在國內外管理共識中仍將SMN2拷貝數(shù)作為SMA診斷的標準步驟之一[\t"/CN112137202040/_blank"2,\t"/CN112137202040/_blank"7]。一般認為，攜帶1個SMN2拷貝的患者是最嚴重的0型，宮內發(fā)病，出生后1個月內死亡；攜帶2個SMN2拷貝的患者通常為1型，大部分在2歲前死亡，早期給予藥物治療及呼吸和營養(yǎng)支持可降低死亡率；攜帶3個SMN2拷貝的患者主要為2型和3型，需要藥物治療和前瞻性干預及定期隨訪；攜帶4個SMN2拷貝數(shù)的患者通常為4型，發(fā)病晚，病情進展緩慢[\t"/CN112137202040/_blank"26,\t"/CN112137202040/_blank"27]。SMN2拷貝數(shù)在以調控SMN蛋白為治療策略的藥物臨床試驗中常常被作為重要參考數(shù)據(jù)[\t"/CN112137202040/_blank"28]，而在新生兒篩查中則被作為癥狀出現(xiàn)前患者治療評估的重要生物學標志物[\t"/CN112137202040/_blank"9]。三、攜帶者及人群攜帶率SMA攜帶者指表型正常但一條染色體上的SMN1基因功能正常而另一條染色體的SMN1基因存在致病性變異的個體。在正常等位基因中，將攜帶1個SMN1基因拷貝定義為1拷貝（1-copy）；將攜帶2個SMN1基因拷貝定義為2拷貝（2-copy）。在致病等位基因中，將攜帶SMN1缺失或因轉換導致的SMN1缺失定義為0拷貝（0-copy）；將攜帶微小變異的SMN1基因定義為1d[\t"/CN112137202040/_blank"8]。因此，SMA攜帶者的SMN1基因型主要分為4種：[1+0]基因型，即外顯子7拷貝數(shù)為1，該攜帶者的一條染色體上SMN1功能正常，另一條染色體上存在SMN1缺失或轉換；[2+0]基因型，即SMN1外顯子7拷貝數(shù)為2，該攜帶者2個功能正常的SMN1基因拷貝位于同一條染色體，另一條染色體上存在SMN1缺失或轉換；[1+1d]和[2+1d]基因型，即SMN1外顯子7拷貝數(shù)≥2，一條染色體上的SMN1功能正常，并且拷貝數(shù)為1或2，另一條染色體上的SMN1基因存在微小變異而功能異常[\t"/CN112137202040/_blank"8]。世界范圍內SMA攜帶率為1/100~1/45[\t"/CN112137202040/_blank"1]，亞洲人群攜帶率約為1/48。一般人群中，[1+0]、[2+0]、[1+1d]和[2+1d]基因型的人群頻率分別為2.58×10-2、1.09×10-3、4.72×10-4和1.99×10-5[\t"/CN112137202040/_blank"29]。而在肯定攜帶者人群中[2+0]頻率約為4%[\t"/CN112137202040/_blank"30]，[1+1d]頻率約為5%[\t"/CN112137202040/_blank"16]。基因診斷SMN1發(fā)生雙等位基因的致病性變異是SMA診斷的主要依據(jù)，臨床診斷或臨床疑似SMA的患者均應進行基因檢測確診。檢測的目標基因為SMN1和SMN2。其中SMN1拷貝數(shù)和致病性變異的檢測結果用于疾病診斷或排除診斷，SMN2拷貝數(shù)的檢測結果作為患者診斷后的治療、臨床管理和預后評估的參考指標。一、基因診斷原則SMA基因診斷應滿足各種SMN1突變基因型患者的診斷，包括SMN1純合缺失患者，即[0+0]基因型；以及SMN1基因復合雜合突變患者，即[0+1d]基因型：（1）在人類基因組中SMN1與SMN2高度同源，基因診斷技術須分別針對SMN1和SMN2。SMN1與SMN2全長轉錄本在外顯子7（c.840C/T）和外顯子8（c.*239G/A）的差異堿基位點作為區(qū)分兩個基因座的主要參考位點。（2）SMN1與SMN2均存在多個轉錄本，為減少致病性變異的誤判，推薦SMN1NM_000344.3和SMN2NM_017411.3全長轉錄本分別作為SMN1與SMN2基因分析的參考序列。（3）應用定量分析技術進行基因檢測時，建議同時報告SMN1和SMN2的拷貝數(shù)。（4）基因診斷明確的患者，其父母有必要進行SMN1檢測，以便確定父母SMN1基因型和患者變異基因的來源，進行遺傳咨詢。二、基因診斷流程：由于95%的SMA患者為SMN1外顯子7純合缺失，應首先進行SMN1拷貝數(shù)定量分析。當受檢者為SMN1外顯子7或外顯子7與8純合缺失，即可診斷為SMN1純合缺失型患者。當受檢者為SMN1雜合缺失，提示需進行另一個SMN1等位基因的序列分析：如檢測到微小致病性變異，該個體診斷為SMN1缺失和微小變異的復合雜合突變患者；如未查到微小致病性變異且臨床表現(xiàn)又不典型，該個體可能僅為SMN1缺失攜帶者，可能是其他疾病患者，需進一步鑒別診斷。當受檢者沒有檢測出SMN1純合缺失或復合雜合變異，但具有明確的SMA臨床診斷，則可能存在檢測范圍外的致病性變異，特別當患者父母為近親婚配時，應進行SMN1基因全序列分析，以確診SMN1雙等位基因均為致病性微小變異的患者?；蛟\斷流程見\t"/CN112137202040/_blank"圖1。三、SMA相關的基因診斷技術（一）拷貝數(shù)檢測技術1．多重連接探針擴增（MLPA）：MLPA方法針對SMN1與SMN2基因第7和第8外顯子堿基差異位點（c.840位點C/T和c.*239位點G/A）設計雜交探針，采用其他染色體位點的多個管家基因作為內參基因，以SMN1∶SMN2不同拷貝數(shù)的樣本作為平行對照，在完成雜交連接等系列反應后，根據(jù)熒光峰面積的比值比來判斷目標基因序列的拷貝數(shù)。MLPA技術通過直接檢測SMN1拷貝數(shù)，明確區(qū)分患者、攜帶者及正常人；還可同時檢測患者的SMN2拷貝數(shù)，是目前國內外SMA管理共識推薦使用診斷SMA的金標準[\t"/CN112137202040/_blank"2,\t"/CN112137202040/_blank"7]。但是該方法不能檢測SMN1基因微小變異與SMN1[2+0]基因型。2．熒光定量PCR：主要原理是通過多重實時熒光定量PCR反應，以管家基因序列為內參，采用Taqman探針法分別對SMN1基因第7和第8外顯子進行拷貝數(shù)相對定量，來判斷是否發(fā)生缺失變異。該方法優(yōu)勢是操作簡便、成本低廉，適用于人群篩查，但其特異性相比MLPA方法略遜，且SMN2拷貝數(shù)需要另外設計探針進行檢測。同樣不能檢測SMN1基因微小變異和[2+0]基因型。（二）SMN1微小變異檢測技術SMN1復合雜合突變患者需要確認發(fā)生在SMN1基因的微小變異。由于SMN1和SMN2高度同源，通常采用SMN1特異性長片段PCR結合巢式PCR的方法或SMN1基因逆轉錄（RT）-克隆測序進行SMN1的變異分析。1．SMN1特異性長片段PCR結合巢式PCR：根據(jù)SMN1和SMN2差異堿基，設計等位基因特異性引物用以特異性擴增整個SMN1來源的基因組DNA序列，再以長片段擴增產物作為模板通過巢式PCR擴增每個外顯子及鄰近的內含子進行序列分析，檢測SMN1序列是否存在基因變異。可以檢測SMN1外顯子和鄰近內含子區(qū)域的微小變異。2．RT-克隆測序方法：提取患者外周血總RNA，逆轉錄后非特異性擴增全長SMN基因（含SMN1和SMN2）cDNA，根據(jù)SMN1和SMN2差異堿基挑選SMN1克隆，通過Sanger測序的方法檢測來源于SMN1cDNA的基因變異。該方法可以檢測外顯子的變異，也可以檢測內含子區(qū)域影響剪接的變異的異常轉錄本，但是不能檢測到調控區(qū)域的變異。3．常規(guī)Sanger測序：因操作簡便，可用于篩查SMN1雜合缺失患者是否存在SMN基因微小變異。但因該方法無法區(qū)分微小變異發(fā)生在SMN1還是SMN2，需要進一步驗證。（三）NGS由于高通量且商業(yè)化，NGS已成為單基因遺傳病基因診斷的首選技術。由于SMN1和SMN2基因高度同源性，并且存在因相互部分轉換形成的SMN1-SMN2融合基因，而目前的測序技術讀長短（比如Illumina測序平臺讀長為100-150bp），因此NGS數(shù)據(jù)的常規(guī)比對拼接方法無法區(qū)別SMN1和SMN2基因的變異，gnomAD數(shù)據(jù)庫內關于SMN1基因變異位點的信息描述也說明這個事實。但由于SMN1和SMN2基因存在2個堿基差異位點（exon7的c.840C/T；exon8的c.*239G/A），實驗室可利用該位點的堿基類型的read比例來推測SMN1基因是否存在雜合或純合缺失，但無法確定SMN1基因缺失長度和SMN2基因拷貝數(shù)。2017年一項研究證實通過改進實驗操作和生物信息學分析流程[\t"/CN112137202040/_blank"31]，NGS可同時檢測SMN1基因拷貝數(shù)和篩查SMN基因微小變異。與MLPA技術相比，其檢測SMN1基因拷貝數(shù)變異的靈敏度可達100%，特異性可達99.6%，但應用該技術篩選出的微小變異未能直接明確存在于SMN1或SMN2基因。2020年，另一項研究也建立了用于篩查SMN1和SMN2拷貝數(shù)的NGS，應用已知陽性病例通過MLPA技術驗證，該技術準確率達到100%[\t"/CN112137202040/_blank"32]。值得注意的是，以上兩項研究均將SMN1和SMN2基因（chr5∶70220768-70248838和chr5∶69345350-69373418）都作為靶向區(qū)域篩選變異，基于SMN1和SMN2基因的差異性位點對常規(guī)測序和生物信息學流程進行改進，使用已知陽性樣本的NGS數(shù)據(jù)作為內標構建SMN1基因的拷貝數(shù)計算公式。以上研究表明，NGS直接計算SMN1拷貝數(shù)的技術將逐漸成熟和準確，但篩查或診斷SMN1微小變異仍存在很大困難。目前在我國，NGS尚未成為SMA的常規(guī)檢測方法，但是其適用于SMA鑒別診斷，即對非5qSMA的神經肌肉病，或者以肌無力為臨床癥狀需要排除診斷的患者開展致病基因變異篩查。如果診斷實驗室只是利用SMN1和SMN2基因的差異位點來推測SMN1基因的雜合或純合缺失，而沒有如以上文獻建立SMN1基因拷貝數(shù)變異的計算方法，則必須使用經典拷貝數(shù)診斷方法（比如MLPA）進行驗證。如果利用NGS篩查SMN1基因的微小變異，則需要說明如何確定該變異發(fā)生在SMN1基因。（四）其他檢測技術SMA傳統(tǒng)的檢測方法還有雙側雙重等位基因特異性PCR（AS-PCR）與聚合酶鏈反應-變性高效液相色譜（PCR-DHPLC）等。對于不具備定量檢測技術條件的檢測機構可以應用定性檢測技術診斷SMN1外顯子7純合缺失病例，例如PCR-酶切分析或者Sanger測序等。但定性檢測技術不能檢測SMN1基因的雜合缺失，可能導致復合雜合突變患者的漏診或誤診。四、基因診斷報告要點1．基本信息：包括被檢測者的個體識別信息，如姓名、性別、出生日期、采集樣本時間、樣本性質、門診號及住院號、送檢醫(yī)生信息等。2．病歷信息：包括患兒癥狀、體征、輔助檢查結果和臨床診斷。3．基因檢測方法：應說明使用的檢測方法、檢測試劑名稱和型號、列出檢測方法的適用范圍、檢測技術的局限性。還應說明SMA的基因型分布的背景資料。4．檢測的目標基因：檢測的基因名稱、基因組位置、基因的轉錄本號。5．檢測結果和結果解讀：（1）拷貝數(shù)檢測報告應包含如下信息：SMN1基因和SMN2基因外顯子7和外顯子8的拷貝數(shù)；（2）基因微小變異分析報告或基因序列分析報告應包含如下信息：SMN1微小變異信息、遺傳模式、變異來源、致病性分析等；（3）建議拷貝數(shù)和基因微小變異的檢測結果報告以表格形式報告，并提供原始的實驗結果圖。6．SMN1變異的致病性分析和命名：SMN1基因外顯子7拷貝數(shù)缺失為明確的致病性變異，單堿基或幾個堿基的微小變異建議參照ACMG制定的基因變異解讀指南[\t"/CN112137202040/_blank"23]，將變異的臨床意義依據(jù)評估證據(jù)進行五級分類：致病性、可能致病性、臨床意義不明、可能良性和良性。致病性和可能致病性變異通常認為是導致疾病發(fā)生的變異，臨床意義不明變異建議結合臨床診斷進行后期數(shù)據(jù)重分析。對于測序發(fā)現(xiàn)的未報道、變異，尤其錯義變異，由于缺乏SMN1基因區(qū)域的正常人群頻率，致病性評估中PM2證據(jù)可能無法使用。致病性變異命名參照國際變異命名網站（/）的標準。7．檢測結論和建議：檢測報告應給出明確的檢測結論。如本檢測方法不能完成患者基因診斷，則應給出是否需要進一步驗證以及驗證方法的建議。五、基因診斷后的臨床管理和遺傳咨詢首先判讀基因檢測報告是否明確了患者的基因型及變異的致病性等，檢測結果是否可以解釋患者的臨床表現(xiàn)，確認遺傳學診斷的有效性。對患者及時進行臨床分型及病情評估，解釋疾病的發(fā)生發(fā)展，開展藥物治療、多學科管理和定期隨訪。延長患者生存周期，提高運動功能，延緩和減輕并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。提供患者及監(jiān)護人遺傳咨詢，包括：遺傳病因、傳遞模式、再發(fā)風險評估、產前診斷或植入前遺傳學檢測等再生育選擇以及家庭成員攜帶者篩查建議等相關信息和指導（\t"/CN112137202040/_blank"圖1）。產前診斷由于SMA的病情嚴重、治療費用昂貴，現(xiàn)階段產前診斷仍然是SMA主要的預防手段。1．SMA產前診斷原則：SMA的產前診斷應在具備產前診斷資質的醫(yī)療機構由具有資質的專業(yè)人員進行。實施產前診斷之前必須預分析或驗證先證者及父母的變異基因型，明確先證者的SMN1變異類型，據(jù)此制定該家系實施產前診斷的策略和診斷技術。產前診斷通常在母孕的早、中期采集胎兒絨毛組織或羊水細胞進行檢測。2．SMA產前診斷的對象：（1）生育過SMA患兒的夫妻；（2）夫妻雙方均為SMA攜帶者；（3）生育過臨床診斷SMA的患兒，但患兒夭折前未行基因診斷，再生育前通過SMN1基因檢測明確雙方為SMA攜帶者的夫妻。3．產前診斷的基因和基因型：SMA產前診斷的檢測基因為SMN1。由于SMN1基因的特殊性，大部分產前診斷機構僅針對SMN1缺失型SMA進行產前檢測；復合雜合變異的SMA家庭行產前診斷前應到有檢測SMN1微小變異經驗的實驗室進行微小變異的確定，再進行產前檢測。對于SMN1缺失型SMA，要參考父母的基因型對胎兒進行基因型判斷。當父母皆為[1+0]基因型，胎兒為SMN1純合缺失型時診斷為SMA受累胎兒。建議進一步檢測SMN2的拷貝數(shù)，在產前遺傳咨詢中可以給予胎兒父母更多關于SMA臨床表型信息，幫助他們對胎兒去留進行決策[\t"/CN112137202040/_blank"33,\t"/CN112137202040/_blank"34]。當胎兒SMN1為1拷貝時，診斷為缺失型攜帶者，表型正常。當胎兒SMN1為2拷貝時，孕胎為基因型和表型正常的個體。如果父母之一基因型為[2+0]時，胎兒SMN1雖有2拷貝，胎兒仍為[2+0]型攜帶者個體，只有拷貝數(shù)為3時，胎兒才是正常個體。4．SMA產前診斷的技術和局限性：SMN1缺失型SMA產前診斷推薦采用MLPA或qPCR技術對胎兒進行SMN1基因拷貝數(shù)分析。這兩個方法均為拷貝數(shù)劑量的檢測，檢測范圍有一定的局限性：（1）如果沒有父母的基因型數(shù)據(jù)，無法檢測胎兒新生的SMN1微小變異；（2）無法檢測胎兒為SMN1[2+0]基因型的攜帶者；（3）無法檢測胎兒SMN1缺失的低比例嵌合體。需要注意的是，由于SMA以SMN1純合缺失型為主，母源污染是導致錯誤產前診斷的重要根源。對絨毛組織要盡可能去除可能的母源組織，當羊水有血性污染時要進行細胞培養(yǎng)，無論是絨毛還是羊水均應同時以STR或SNPs為標記進行連鎖分析，排除母源污染的可能。5．SMA產前診斷前后的遺傳咨詢[\t"/CN112137202040/_blank"34]：產前診斷前的遺傳咨詢需告知以下要點：（1）SMA產前診斷的目的是了解孕胎攜帶致病基因的情況。孕胎產前診斷的可能結果包括正常個體、攜帶者或受累胎兒。獲得產前診斷結果后胎兒的取舍由其父母知情選擇。（2）SMA為常染色體隱性遺傳病，父母均為攜帶者時，每次生育SMA患兒的再發(fā)風險為25%，男女患病機會均等。SMN1[1+0]和[2+0]基因型攜帶者家庭的再發(fā)風險和產前診斷策略相同。（3）產前診斷的基因檢測范圍僅限于檢測SMN1和SMN2基因的拷貝數(shù)或某個特定的微小變異；（4）產前檢測所用的方法及原理，方法的敏感度、特異度、局限性和準確度；（5）胎兒取材的種類和時間，產前診斷的價格和報告時間；（6）還要特別告知，產前診斷取材中可能會無法避免母源污染，有需要重新取材的可能；（7）獲得SMA產前檢測報告后需進行遺傳咨詢。產前診斷后的遺傳咨詢主要包括：（1）針對目前檢測結果是否還需進一步的檢測；（2）告知產前檢測結果，如為受累胎兒，告知疾病相關信息；（3）當胎兒診斷為SMA受累胎兒并選擇出生時，應給予相關治療和干預措施等醫(yī)學信息和建議；（4）需要強調SMN2的拷貝數(shù)與胎兒出生后的臨床表型不完全相關，SMN2拷貝數(shù)僅作為胎兒臨床表型預測的參考。植入前遺傳學檢測胚胎植入前遺傳學檢測（PGT）是指將輔助生殖技術（ART）和遺傳學分析技術相結合，對生育遺傳病患兒高風險家庭進行胚胎活檢和遺傳檢測，選擇已知疾病不受累的胚胎植入子宮從而獲得健康的子代。一、SMA的PGT原則（1）由于胚胎基因診斷技術仍為有創(chuàng)檢測，PGT原則上僅針對嚴重致畸、致殘、致死性或者治療費用極其昂貴的遺傳性疾病，大部分SMA屬于此類型遺傳疾病，滿足單基因遺傳病PGT（PGT-M）的指征；（2）基因突變攜帶者或先證者基因檢測結果明確；（3）夫妻雙方對胚胎基因診斷的流程和風險充分了解，接受并出于主觀愿望進行胚胎植入前基因診斷。二、SMA-PGT適宜人群（1）夫妻雙方均為SMA基因突變攜帶者；（2）夫妻中有一方或雙方血液基因組SMN1未見異常，如僅有一次SMA患兒生育或妊娠史，首先推薦產前診斷；如有2次及以上SMA患兒生育史或妊娠史，不排除生殖腺嵌合或一方為SMN1[2+0]基因型的可能性，這種情況符合PGT指征；（3）由于基因和突變類型的特殊性，攜帶SMN1基因突變的遺傳家系進行PGT，需提供試驗所需的完整核心家系成員的樣本（血液、組織或者DNA等）；（4）夫妻雙方無不適宜實施輔助生殖術的禁忌癥。三、PGT的目標基因及SMN1突變基因型1．PGT檢測的目標基因為SMA的致病基因SMN1，SMN2不在檢測范圍。2．PGT技術目前大多采用堿基位點（SMN1和SMN2外顯子7差異位點或微小變異位點）直接檢測聯(lián)合家系連鎖分析的檢測策略，這種策略在必需家系成員樣本滿足要求的條件下，理論上對SMN1突變類型并無特殊限制。缺失型突變選擇SMN1與SMN2在外顯子7上的差異位點c.840C/T作為檢測目標，以區(qū)分SMN1純合缺失和非純合缺失。對于SMN1致病性微小變異的檢測，由于SMN2的干擾，應用PCR技術直接檢測變異位點存在一定的困難。近年來NGS在PGT上逐漸運用，大大提高了SMN1微小變異的檢出率。該項技術將含有微小變異位點的PCR產物與胚胎單細胞全基因組擴增產物混合，進行全基因組測序，通過直接分析目標位點比對的堿基，可清晰地判斷變異堿基所占的比例。但無論缺失突變還是微小變異，均需聯(lián)合家系連鎖分析，以判斷胚胎基因攜帶突變的準確情況[\t"/CN112137202040/_blank"35,\t"/CN112137202040/_blank"36]。四、SMA胚胎基因檢測的技術和局限性（一）PGT檢測樣本PGT檢測樣本可以來源于胚胎植入前的三個階段：（1）極體（第一極體和第二極體）；（2）卵裂期單個卵裂球（發(fā)育到第3天胚胎）；（3）囊胚期滋養(yǎng)層細胞（發(fā)育到第5至6天胚胎）。目前大多采用囊胚期進行滋養(yǎng)層細胞活檢[\t"/CN112137202040/_blank"37]。（二）PGT-M關鍵技術1．胚胎單細胞全基因組擴增技術（WGA）：胚胎活檢樣本通常為單個或極少量細胞，需經過全基因組擴增后方能用于后續(xù)遺傳學檢測。多種單細胞基因組擴增方法各有優(yōu)勢，可選擇性應用于PGT-M[\t"/CN112137202040/_blank"38,\t"/CN112137202040/_blank"39]。2．SMA的PGT-M檢測技術：如上所述，PGT-M檢測包括堿基位點直接檢測聯(lián)合家系連鎖分析。單細胞全基因組擴增產物進行位點檢測的方法，可采用特異性PCR或酶切等方法。家系連鎖分析主要依靠基因上下游或基因內部的特異性STR或SNP。采用NGS，可獲得基因上下游充足的SNP位點，選用靠近基因上下游各三個以上有效SNP進行一代驗證（盡量在基因上下游1~2Mb以內）。這種方法相對于STR分型，更利于確定染色體重組的具體位置，從而能更準確判斷基因突變攜帶情況。目前這種檢測策略被廣泛用于PGT-M中[\t"/CN112137202040/_blank"35]。3．局限性：這種主要依賴家系連鎖分析的檢測策略可以對大部分遺傳家系胚胎進行準確診斷。但對于家系不全的夫妻的胚胎檢測，雖然可以借助極體或單個精子的優(yōu)勢作為家系連鎖分析的根據(jù)[\t"/CN112137202040/_blank"40]，但由于目前所應用的單細胞擴增方法還不能完全解決等位基因脫扣（ADO）的問題，給極體和單精子突變位點的檢測帶來一定誤差。因此對于家系不全的夫妻的胚胎檢測，除PGT-M流程前的風險告知和知情同意外，移植后妊娠中期的產前診斷是必要的。五、SMA胚胎診斷前后的遺傳咨詢與知情同意1．PGT前：試管前遺傳咨詢是PGT的關鍵環(huán)節(jié)（咨詢內容同產前診斷）。生殖科臨床醫(yī)生（具遺傳背景）根據(jù)患者的生育力評估和家系狀況，告知患者PGT流程、風險和技術的局限性，簽署知情同意。2．PGT后：胚胎檢測結束后，在胚胎移植前，夫婦依據(jù)檢測報告再次進行遺傳咨詢，確定是否移植和移植順序。簽署移植知情同意后啟動移植流程。3．移植后驗證與隨訪：PGT胚胎移植后如成功妊娠，孕中期建議進行羊水細胞基因驗證。新生兒發(fā)育隨訪與所有植入前胚胎遺傳學檢測策略相同。攜帶者篩查由于SMA病情嚴重、人群攜帶率高、檢測方法可靠經濟、遺傳咨詢和產前診斷可行，2008年ACMG建議不僅有SMA家族史的夫婦應接受攜帶者篩查，而且所有種族和民族的一般人群都應接受SMA攜帶者篩查[\t"/CN112137202040/_blank"10]；2009年美國婦產科學會（ACOG）建議孕前和懷孕早期的婦女應進行SMA攜帶者篩查[\t"/CN112137202040/_blank"41]。1．攜帶者篩查的適宜人群：（1）高危人群：確診為SMA患者的家庭成員，SMA患者或攜帶者的配偶。（2）一般人群：目前，我國尚無SMA攜帶者篩查的指南，根據(jù)已發(fā)表的文獻報道，中國SMA攜帶率為1/42~1/48[\t"/CN112137202040/_blank"3,\t"/CN112137202040/_blank"22,\t"/CN1121