生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件

第三章生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程1生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024

第一節(jié)生物技術(shù)藥物生產(chǎn)簡(jiǎn)介

一、一般生產(chǎn)過(guò)程

生物技術(shù)藥物的生產(chǎn)可分為上游和下游兩個(gè)階段。上游階段是指構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)的工程細(xì)胞(或工程菌)，主要包括目的基因的分離，工程菌的構(gòu)建與篩選；下游階段是指工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)，一直到產(chǎn)品的分離純化、制劑、質(zhì)量控制等一系列工藝過(guò)程。2生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024獲得目的的基因↓構(gòu)建重組體↓構(gòu)建基因工程菌(或工程細(xì)胞)↓大規(guī)模培養(yǎng)工程菌↓產(chǎn)物分離純化↓除菌過(guò)濾↓半成品檢定↓制劑↓成品檢定↓包裝生物技術(shù)藥物生產(chǎn)一般過(guò)程

生物技術(shù)藥物制造過(guò)程的主要程序是：獲得目的基因→構(gòu)建DNA重組體→將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞→鑒定篩選陽(yáng)性克隆→構(gòu)建基因工程菌（或工程細(xì)胞）→培養(yǎng)工程菌→分離純化表達(dá)產(chǎn)物→除菌過(guò)濾→半成品檢定→制劑→成品檢定→包裝．3生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20241、獲得具有遺傳信息的目的基因從復(fù)雜的生物體基因組中采用不同方法分離并獲得帶有目的基因的DNA片段。獲得目的基因主要通過(guò)下述方法。(1)用限制性內(nèi)切酶法直接分離目的基因質(zhì)粒和病毒等DNA分子小的幾kb,大的幾百kb,編碼的基因較少,直接用限制性內(nèi)切酶法獲得目的基因（2）人工合成目的基因人工合成目的基因主要采用下列3種途徑。①酶促方法經(jīng)提取獲得編碼基因的信息RNA（mRNA），在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成互補(bǔ)DNA（cDNA）鏈，在DNA聚合酶I的作用下，加工成為雙鏈DNA分子。②化學(xué)合成法前提是必須已知基因的核苷酸序列，化學(xué)合成的DNA片段一般較短，需要用DNA連接酶進(jìn)行連接，從而獲得較長(zhǎng)的DNA片段。③聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）先決條件是必須已知基因的核苷酸序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因。也可以采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）等方法，直接從富含目的基因的實(shí)驗(yàn)材料提取RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下獲得cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因。(3)構(gòu)建基因組文庫(kù)從cDNA文庫(kù)分離目的基因4生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20242、選擇基因載體構(gòu)建重組NDA在體外將含目的基因的DNA片段和具有自我復(fù)制功能、并帶有選擇標(biāo)記的載體分子進(jìn)行酶切連接，獲得重組DNA分子。常見(jiàn)基因載體有質(zhì)粒、噬菌體（phage）、黏粒（cosmid）、病毒載體等。3、將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞采用特定的方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)移至適當(dāng)受體細(xì)胞（也稱寄主細(xì)胞），并與之同步增殖。被導(dǎo)入的受體細(xì)胞分為兩大類(lèi)：第一類(lèi)為原核細(xì)胞，目前常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等。第二類(lèi)為真核細(xì)胞，其中真核微生物主要有酵母、絲狀真菌等，此外為動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞。另外也可以導(dǎo)入動(dòng)物和植物體。導(dǎo)入的方法主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等方法，此外也可采用電融合、顯微注射和基因槍等技術(shù)。5生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20244、鑒定帶有目的基因的克隆從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出克隆有重組DNA分子的寄主細(xì)胞。為了挑選出重組子，針對(duì)不同基因的表達(dá)產(chǎn)物，采用各自特有的測(cè)活方法確定其生物活性；也可以采用酶聯(lián)免疫方法確定其抗原性；以目的基因?yàn)樘结?，通過(guò)DNA雜交方法可以直接確定重組子。5、目的基因的擴(kuò)增及獲得目的產(chǎn)物培養(yǎng)克隆有目的基因的重組子，提取獲得擴(kuò)增的目的基因以進(jìn)行深入的研究。將目的基因克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，采用特定的方法將基因?qū)胧荏w細(xì)胞，使其在新的遺傳背景下獲得活性表達(dá)，從而得到人類(lèi)需要的特定目的物質(zhì)6生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20247生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20246、大規(guī)模培養(yǎng)工程菌基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程主要包括：①通過(guò)搖瓶操作了解工程菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)條件，如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分以及碳氮比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對(duì)受體菌的影響；②通過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案及順序。由于工程菌生長(zhǎng)和異源基因表達(dá)之間有著較大的差異，各培養(yǎng)參數(shù)在全過(guò)程中必須分段控制。在不同的發(fā)酵條件下，工程菌的代謝途徑也不一樣，因而對(duì)下游的純化工藝會(huì)造成不同的影響。因此在高表達(dá)高密度發(fā)酵的前提下，還要盡量建立有利于純化的發(fā)酵工藝，以提高產(chǎn)品的純度及改善其性質(zhì)。8生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20247、根據(jù)研制產(chǎn)品的物理化學(xué)性質(zhì),選擇合理的分離純化方法基因工程產(chǎn)物分離純化的費(fèi)用約占整個(gè)生產(chǎn)費(fèi)用的80%～90%，因此，該工藝過(guò)程理所當(dāng)然地應(yīng)受到高度的重視。然而基因工程產(chǎn)物的分離純化過(guò)程與傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)物相比，具有下列特點(diǎn)：（1）產(chǎn)物大多處于細(xì)胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，增加了很多困難；（2）產(chǎn)物濃度較低、雜質(zhì)多、而最后成品要求達(dá)到的純度高，故提取較困難，且收率低，常需好幾步操作并需采用高分辨力的精制方法；（3）產(chǎn)物都是大分子蛋白質(zhì)，通常不穩(wěn)定，遇熱、極端pH、有機(jī)溶劑和剪切力等易引起失活。各種產(chǎn)物表達(dá)形式所采用的分離純化方法不同。純化方法對(duì)重組蛋白的化學(xué)性質(zhì)、構(gòu)象等都有重要影響，合理的純化方法至少要包括以下幾方面:純化步驟少產(chǎn)物的純度、活性及其他檢測(cè)指標(biāo)達(dá)到規(guī)定要求得率高在確定純化工藝時(shí)要多借鑒最新的分離純化技術(shù)并計(jì)算相關(guān)技術(shù)成本,要考慮到將來(lái)生產(chǎn)工藝放大以后的可行性，在研制階段所得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),要為將來(lái)的生產(chǎn)放大提供充分的依據(jù)。在現(xiàn)實(shí)中,有許多廠家，企業(yè)拿到某種產(chǎn)品的新藥證書(shū)和生產(chǎn)批文,但市場(chǎng)上遲遲見(jiàn)不到該品種上市的現(xiàn)象比比皆是，除生產(chǎn)廠家有自己的產(chǎn)品上市銷(xiāo)售安排之外,生產(chǎn)工藝先天不足也是一個(gè)主要的原因。9生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024分離純化的一般流程10生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20248、劑型，配方，規(guī)格和穩(wěn)定性結(jié)合我國(guó)現(xiàn)階段物流運(yùn)輸?shù)膶?shí)際情況,最好選擇凍干劑型,凍干劑型易于運(yùn)輸和保存,但在凍干過(guò)程中產(chǎn)品易發(fā)生聚集,生物活性可能會(huì)受到影響，而液體制劑在臨床使用上比較方便，合適的產(chǎn)品配方對(duì)產(chǎn)品的活性保持非常重要。根據(jù)劑型的特點(diǎn)和現(xiàn)有的同類(lèi)產(chǎn)品的輔料,找出自己最合適的,并進(jìn)行穩(wěn)定性考察。選擇合適的產(chǎn)品規(guī)格,對(duì)于產(chǎn)品的臨床使用和上市銷(xiāo)售非常重要，有些產(chǎn)品臨床使用劑量大,而小規(guī)格的產(chǎn)品造成終端用戶使用極不方便。根據(jù)藥效學(xué)研究的結(jié)果,參照將來(lái)臨床使用的劑量來(lái)確定合理的制劑規(guī)格，如果所開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品國(guó)外已經(jīng)上市,應(yīng)盡可能參照已上市產(chǎn)品的規(guī)格和劑型。穩(wěn)定性考察是對(duì)產(chǎn)品的劑型、配方及儲(chǔ)存條件確定的綜合評(píng)價(jià)。特別是基因工程藥物,穩(wěn)定的生物活性是其安全有效的保證，應(yīng)在充分研究同類(lèi)或相近產(chǎn)品的穩(wěn)定性考察溫度和本品的生物化學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上,制訂好考察周期,根據(jù)質(zhì)檢規(guī)程的要求進(jìn)行檢測(cè)為產(chǎn)品的有效期確定提供科學(xué)依據(jù)。11生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024NDV-F（新城疫弱毒株）誘生人臍血干細(xì)胞，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成DNA，構(gòu)建質(zhì)粒，經(jīng)克隆篩選獲得有目的基因的質(zhì)粒pBV867,轉(zhuǎn)化到大腸干菌中，干擾素基因在啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)錄。發(fā)酵，收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的的pBV867工程菌，用溶菌酶或高壓勻漿破菌后，裂解液用85%硫酸胺鹽析，酸化使70%雜蛋白變性，然后過(guò)CM-22和DEAE-22離子交換層析，分段洗脫，超濾濃縮，再過(guò)干擾素單抗親和層析柱，可純化2500倍，純度達(dá)95%以下，經(jīng)分裝，凍干即成。12生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024二、生物技術(shù)藥品質(zhì)量保證要素（一）藥典（pharmacopia）（二）質(zhì)量保證體系藥品的質(zhì)量保證起始于新藥的研究與開(kāi)發(fā)，并貫穿于生產(chǎn)銷(xiāo)售和使用的各個(gè)環(huán)節(jié)。1.研究與開(kāi)發(fā)者，臨床前研究，GLP(goodlaboratorypractice藥品非臨床研究質(zhì)量規(guī)范)2.臨床研究單位，GCP(Goodclinicalpractice藥品臨床試驗(yàn)管理規(guī)范)3.藥品生產(chǎn)企業(yè)，GMP(GoodManyfacturingpractice藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)4.藥品經(jīng)銷(xiāo)商，GSP(Goodsupplyingpractice醫(yī)藥商品質(zhì)量管理規(guī)范)5.醫(yī)院，消費(fèi)者，GUP(Goodusepractice醫(yī)藥商品使用管理規(guī)范)6.中藥栽培企業(yè)，GAP（GoodAgriculrurePractice中草藥栽培規(guī)范）7.醫(yī)院藥房和藥劑科，GPP（GoodPharmacyPractice醫(yī)院藥房質(zhì)量管理規(guī)范）QA（QualityAssurance

質(zhì)量保證）——GMP——QC（QualityControl質(zhì)量控制）

13生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/202414生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024(三)生產(chǎn)車(chē)間與設(shè)備制藥車(chē)間設(shè)備包括生產(chǎn)專(zhuān)門(mén)設(shè)施區(qū)、質(zhì)量控制區(qū)和貯存區(qū)。潔凈區(qū)是安裝有制藥設(shè)備并受?chē)?yán)格環(huán)境潔凈控制的區(qū)域，注射劑或無(wú)菌生物藥物必須在潔凈區(qū)生產(chǎn)，潔凈區(qū)需特殊設(shè)計(jì)以防止產(chǎn)品受到污染，常見(jiàn)的污染物有微生物與顆粒物質(zhì)。潔凈區(qū)的環(huán)境監(jiān)測(cè)：空氣懸浮粒子標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測(cè)微生物限度監(jiān)測(cè)人員監(jiān)測(cè)15生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024純化水和注射用水系統(tǒng)純化水：為原水經(jīng)離子交換法、反滲透法、蒸餾法或其他適宜方法制得的供藥用的水，不含任何附加劑，可作為配制普通藥物制劑用的溶劑或試驗(yàn)用水，不能于注射劑的配制。注射用水：為純化水經(jīng)蒸餾所得的水，應(yīng)符合細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)要求，可作配制注射劑用的溶劑。(四)制藥用水系統(tǒng)

16生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/202417生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024注射用水制造流程圖18生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024（五）生產(chǎn)許可1、工藝規(guī)程闡述生產(chǎn)一定量的某一藥品所需原料、輔料、包裝材料、半成品和成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及批生產(chǎn)處方，生產(chǎn)規(guī)程，作業(yè)方法，中間控制方法和注意事項(xiàng)的一套文件。2藥品的批準(zhǔn)文件新藥證書(shū)或藥品批準(zhǔn)書(shū)藥品生產(chǎn)許可證GMP批準(zhǔn)文號(hào)：藥品批準(zhǔn)文號(hào)為：國(guó)藥準(zhǔn)字＋1位字母＋8位數(shù)字；化學(xué)藥品使用字母“H”，中藥使用字母“Z”，生物制品使用字母“S”，進(jìn)口分包裝藥品使用字母“J”等。數(shù)字第1、2位為原批準(zhǔn)文號(hào)的來(lái)源代碼，。第3、4位為換發(fā)批準(zhǔn)文號(hào)之年公元年號(hào)的后兩位數(shù)字。數(shù)字第5至8位為順序號(hào)。

3、生產(chǎn)方法(manufacturingmethod)生產(chǎn)某一藥品標(biāo)準(zhǔn)批量的基本方法、流程及原則要求。注意生產(chǎn)處方與終產(chǎn)品處方的區(qū)別。

19生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20244、生產(chǎn)過(guò)程控制方法及標(biāo)準(zhǔn)為保證藥品批間質(zhì)量的均一性，進(jìn)行生產(chǎn)過(guò)程控制或中間品的質(zhì)量控制，目的是監(jiān)控生產(chǎn)全程，及時(shí)查明中間品和產(chǎn)品變異質(zhì)量的偏差。5、原、輔料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、如：糊精,乳糖,淀粉明膠,乙醇,甘油,殼聚糖,甲殼素,聚維酮,活性碳,凡士林,丙二醇,包衣粉,硬脂酸鎂,聚乙二醇,空心膠囊,微粉硅膠,纖維素系列等6、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分為外控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。外控標(biāo)準(zhǔn)就是產(chǎn)品的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)或法定標(biāo)準(zhǔn)(如藥典標(biāo)準(zhǔn)、部頒標(biāo)準(zhǔn))、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)是企業(yè)控制標(biāo)準(zhǔn)，一般檢查項(xiàng)目多于外控標(biāo)準(zhǔn)或項(xiàng)目的限定指標(biāo)嚴(yán)于外控標(biāo)準(zhǔn)或二者兼有。20生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20247、包裝材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)8、穩(wěn)定性考察藥品穩(wěn)定性是指藥品保持其物理、化學(xué)、生物學(xué)穩(wěn)定性及其療效和安全性的能力，確保藥品在有效期內(nèi)的安全性與有效性。包括三部分內(nèi)容：影響因素試驗(yàn)，加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期留樣考察。9、變更控制和登記21生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024一、生物技術(shù)藥物表達(dá)系統(tǒng)（一）原核生物細(xì)胞1、大腸桿菌A.表達(dá)方式細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)：包含體胞內(nèi)可溶性表達(dá)：分離純化較困難細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)：用滲透振擾法分離產(chǎn)物,可避免細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解，或使表達(dá)的蛋白正確折疊，或去除N--末端的甲硫氨酸，胞外分泌型表達(dá)：通過(guò)信號(hào)肽攜帶等操作，是最優(yōu)選的方法。第二節(jié)生物技術(shù)藥物來(lái)源與質(zhì)量控制22生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024

1）

細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)產(chǎn)物

包涵體的分離純化包涵體是在大腸桿菌高表達(dá)系統(tǒng)中,某些目的蛋白質(zhì)以不溶性形式產(chǎn)生并聚集形成蛋白質(zhì)聚合物。包涵體可以較容易地與胞內(nèi)可溶性蛋白雜質(zhì)分離，但因包涵體中重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)了一個(gè)變性復(fù)性過(guò)程，較易形成蛋白產(chǎn)物的錯(cuò)誤折疊和聚合體包涵體的分離及其中重組蛋白質(zhì)的純化通常包括以下步驟（1）.菌體細(xì)胞的收集與破碎；

（2）.包涵體的分離、洗滌與溶解；

（3）.變性蛋白質(zhì)的純化；（4）.重組蛋白質(zhì)的復(fù)性。2）

分泌型表達(dá)產(chǎn)物的分離純化分泌型的表達(dá)產(chǎn)物通常體積大、濃度低、必需在純化以前進(jìn)行濃縮處理，盡快縮小溶液體積。超濾是目前最常用的蛋白質(zhì)溶液濃縮方法。其優(yōu)點(diǎn)是不發(fā)生相變化，也不需要加入化學(xué)試劑，能耗低。

23生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20243）

大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)產(chǎn)物的分離純化某些細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素2、11）和硫氧還原蛋白的基因能在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)可溶性的融合蛋白。這種表達(dá)方式可避免無(wú)活性的不可溶包涵體的形成，使外源蛋白在細(xì)胞中能正確折疊,從而獲得特定空間結(jié)構(gòu)和生物功能,并以可溶性形式表達(dá)。經(jīng)細(xì)胞破碎后的可溶性離心上清液，可選用親和層析法或離子交換法分離純化4）

大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)蛋白的分離純化周質(zhì)表達(dá)的蛋白可以避開(kāi)細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類(lèi)雜質(zhì)，有利于蛋白產(chǎn)物的分離純化,通常能夠回收到高質(zhì)量的蛋白產(chǎn)物。為了獲取周質(zhì)蛋白，細(xì)胞經(jīng)低濃度溶菌酶處理后，一般用滲透壓休克（先用高滲蔗糖（20%）處理細(xì)胞，再用低滲溶液處理細(xì)胞使其脹破，此時(shí)便可對(duì)釋放出來(lái)的胞漿蛋白質(zhì)進(jìn)行分離）的方法獲取。24生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/202425生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024B.不足分泌能力不足，真核蛋白在E.coli中常形成不溶性包含體，表達(dá)產(chǎn)物必須變性和復(fù)性處理才能使目的蛋白恢復(fù)生物活性。在E.coli表達(dá)體系中不存在翻譯后修飾作用，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能進(jìn)行糖基化，因此只能用于表達(dá)不需糖基化作用的真核蛋白。由于翻譯常從起始密碼子AUG(甲硫氨酸)開(kāi)始，因此目的蛋白的N末端常多了一個(gè)甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應(yīng)。大腸桿菌還會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，故目的產(chǎn)品應(yīng)作內(nèi)毒素檢測(cè)產(chǎn)生蛋白酶會(huì)破壞目的蛋白C解決方法：降低培養(yǎng)溫度(從37℃降到30℃)以硫氧還原蛋白為載體進(jìn)行融合蛋白表達(dá)

26生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復(fù)合物,它的特殊性不是細(xì)菌或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物,而是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來(lái)的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質(zhì)。其化學(xué)成份主要是由O-特異性鏈、核心多糖、類(lèi)脂A三部分組成。類(lèi)脂A是內(nèi)毒素多種生物活性或毒性反應(yīng)的主要基團(tuán)。該基團(tuán)沒(méi)有種屬特異性,所以各屬細(xì)菌的類(lèi)脂A結(jié)構(gòu)相似,其毒性反應(yīng)相似。如發(fā)熱、血液流動(dòng)力學(xué)改變、彌漫性血管內(nèi)凝血,并導(dǎo)致休克等。內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì),熱穩(wěn)定性強(qiáng)。在100℃的高溫下加熱1h也不會(huì)被破壞,115℃30min濕熱僅能破壞25%左右的熱原質(zhì)。只有180℃3~4h或250℃1~2h干烤,或用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加溫煮沸30min才能破壞它的生物活性。內(nèi)毒素帶有負(fù)電荷,由于脂多糖結(jié)構(gòu)中類(lèi)脂A的疏水性,使得內(nèi)毒素傾向于以高分子聚合物的狀態(tài)存在而難溶于水,并由于環(huán)境中Ca2+、Mg2+等被吸引到帶負(fù)電荷的脂多糖上而得以穩(wěn)定。通常其分子量幾十萬(wàn)至上百萬(wàn)道爾頓。27生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024內(nèi)毒素的產(chǎn)生

基因工程蛋白通常采用細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞作為宿主進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn),但大多是以大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)。以大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)的蛋白通常都是在胞內(nèi)表達(dá),在純化蛋白之前必須通過(guò)高壓勻漿、超聲波破碎或低壓滲透等方法將菌種破壁,以釋放蛋白。同時(shí)細(xì)胞壁內(nèi)的脂多糖也大量釋放到緩沖液中,通常10%的濕菌濃度可產(chǎn)生內(nèi)毒素,這是內(nèi)毒素的主要來(lái)源。生產(chǎn)中去除內(nèi)毒素，主要是采用各種柱層析技術(shù),如疏水層析、離子交換、親和層析、分子篩等,這些技術(shù)純化目標(biāo)產(chǎn)品的同時(shí)也可以有效去除內(nèi)毒素。28生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20242枯草芽孢桿菌

A、優(yōu)點(diǎn)：分泌能力強(qiáng)，表達(dá)產(chǎn)物可直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。B缺點(diǎn)：不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，另外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)降解表達(dá)產(chǎn)物。3鏈霉菌A特點(diǎn)：不致疾、使用安全、分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力。B缺點(diǎn)：操作比大腸桿菌復(fù)雜，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化頻率低用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子少。29生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024（二）真核生物細(xì)胞1、酵母A特點(diǎn)：酵母易繁殖，可以大規(guī)模廉價(jià)培養(yǎng)，而且沒(méi)有毒性，能將表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外，表達(dá)產(chǎn)物能糖基化，在細(xì)菌中難于表達(dá)的真核基因在酵母中可獲得高效表達(dá)。它有以下特點(diǎn)：①是真核表達(dá)體系，對(duì)表達(dá)蛋白可進(jìn)行折疊和翻譯后修飾與糖基化；②表達(dá)量高，如明膠表達(dá)量達(dá)14.8g/L;③培養(yǎng)基成本低；④適用高密度發(fā)酵；⑤雜蛋白少，產(chǎn)物易純化。B缺點(diǎn)色素難以除去啤酒酵母表達(dá)量偏低；大量表達(dá)時(shí)，常會(huì)有質(zhì)粒丟失；重組蛋白發(fā)生超糖基化；分泌蛋白留在壁膜間隙，增加了純化難度。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)于啤酒酵母。30生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20242、哺乳動(dòng)物細(xì)胞A優(yōu)點(diǎn)：哺乳動(dòng)物細(xì)胞可將表達(dá)產(chǎn)物由重組轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，使產(chǎn)物易于純化。哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的表達(dá)產(chǎn)物是糖基化的，接近或類(lèi)似天然產(chǎn)物?？色@得結(jié)構(gòu)與天然蛋白相一致的活性蛋白，對(duì)于制造結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物藥物是其它系統(tǒng)所無(wú)法比擬的。B缺點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、生產(chǎn)效率低、培養(yǎng)條件苛刻、費(fèi)用高，培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度稀，因此生產(chǎn)成本高，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模有較大困難。常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO細(xì)胞)和幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)31生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危險(xiǎn)性大腸桿菌多肽、蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易部分可獲高產(chǎn)一般對(duì)原核者好真核者稍差不大酵母多肽、蛋白質(zhì)或糖基化蛋白菌體內(nèi)或分泌出細(xì)胞容易可高產(chǎn)菌體內(nèi)稍復(fù)雜真核的接近天然不大哺乳動(dòng)物細(xì)胞完整糖基化蛋白分泌出細(xì)胞較難、成本高可高產(chǎn)簡(jiǎn)單幾乎可為天然產(chǎn)物需注意有致癌因素32生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024考慮事項(xiàng)大腸桿菌酵母哺乳細(xì)胞ＤＮＡ的大小和特點(diǎn)4.6Mb，環(huán)形ＤＮＡ12.1Mb，染色體ＤＮＡ2000-3000Mb，染色體ＤＮＡ翻譯后修飾沒(méi)有可能，但不同于人可能，類(lèi)似或同人一樣生長(zhǎng)率（每小時(shí)循環(huán)數(shù)）3.33/h0.25/h0.02/h培養(yǎng)方法發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵（懸浮細(xì)胞）轉(zhuǎn)瓶（粘附細(xì)胞）成本低中間>100萬(wàn)美元／kg在制藥規(guī)模上選擇宿主細(xì)胞用于重組藥物的表達(dá)中一些關(guān)鍵事項(xiàng)的比較33生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20243昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲(chóng)細(xì)胞可進(jìn)行信號(hào)肽的切除，糖基化等蛋白質(zhì)翻譯后加工，并能進(jìn)行適當(dāng)?shù)募?xì)胞分區(qū)和胞外分泌表達(dá)。主要包括桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（stabletransformationsystem）兩種。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)將目的基因克隆至帶有編碼桿狀病毒多角體或P10啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)染載體上，獲得重組桿狀病毒，感染昆蟲(chóng)細(xì)胞［sf-9，sf-2］，BTI-ΤΝ-5Β1-4（HighFiveTM）］進(jìn)行表達(dá)。該系統(tǒng)表達(dá)的抗體盡管每個(gè)細(xì)胞的表達(dá)水平是原核細(xì)胞的50～100倍，但仍為可溶性。另外，桿狀病毒有嚴(yán)格的宿主傳導(dǎo)性，增加了該系統(tǒng)的安全性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)克服了病毒感染引起細(xì)胞死亡的缺點(diǎn)，Mahiouz等將抗E-選擇素的單鏈抗體基因克隆于果蠅金屬硫蛋白啟動(dòng)子下，轉(zhuǎn)染果蠅細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞克隆，培養(yǎng)上清中抗體含量達(dá)到0.2～0.4mg/L。34生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20244、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過(guò)基因工程的手段對(duì)動(dòng)物基因組的結(jié)構(gòu)或組成進(jìn)行人為的修飾，并通過(guò)相應(yīng)的動(dòng)物育種技術(shù)使這些經(jīng)修飾改造后的基因組在世代間得以穩(wěn)定的傳遞和表達(dá)。動(dòng)物基因組中穩(wěn)定地整合含有外源性基因的動(dòng)物?？梢源笕萘俊⒘畠r(jià)地生產(chǎn)復(fù)雜蛋白建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的幾種途徑受精卵或卵細(xì)胞DNA直接顯微注射胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和育種體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移和克隆35生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024

5轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)把分離的基因與來(lái)自植物、病毒、細(xì)菌的啟動(dòng)子相連接,然后再轉(zhuǎn)移到植物受體細(xì)胞內(nèi)來(lái)表達(dá)，外源基因整合到植物受體細(xì)胞染色體組上并復(fù)制，從而使外源基因能在植物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定的表達(dá)。目前常用的啟動(dòng)子主要是CaMV35sRNA啟動(dòng)子,另外還有玉米泛素Ⅰ型啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。內(nèi)含子順序常用于外源基因在單子葉植物中的表達(dá)。在植物中表達(dá)基因產(chǎn)物具有誘人的前景，如表達(dá)基因工程抗體可達(dá)葉總蛋白的1.3％。可大規(guī)模生產(chǎn)治療和診斷用的醫(yī)用抗體。生產(chǎn)成本比其它任何來(lái)源抗體都要低。植物細(xì)胞的糖基化與哺乳細(xì)胞相似，但能產(chǎn)生一些不同哺乳細(xì)胞的糖類(lèi)殘基（木糖殘基），而缺乏哺乳動(dòng)物常見(jiàn)的末端殘基——唾液酸。

36生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/202437生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024

由于轉(zhuǎn)基因植物中形成的重組蛋白質(zhì)具有相對(duì)穩(wěn)定、表達(dá)量低、不易消毒、結(jié)構(gòu)不易確定及翻譯修飾后造成活性差異和生物活性取決于正確結(jié)構(gòu),甚至折疊方式等特點(diǎn)，因此必須制定相應(yīng)的安全管理?xiàng)l例以確保使用這些藥物和用做藥品的這些產(chǎn)物(藥物)的安全性和有效性。全面考慮轉(zhuǎn)基因植物的遺傳穩(wěn)定性、微生物污染、純度、產(chǎn)物的可比較性及環(huán)境影響和污染情況等眾多因素并且制定必要的規(guī)范化管理?xiàng)l例是必要的,而且這樣會(huì)積極推動(dòng)本領(lǐng)域的研究工作。目前我國(guó)已有中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基因工程安全管理辦公室等單位專(zhuān)門(mén)負(fù)責(zé)此方面內(nèi)容的申報(bào)及安全管理工作。38生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/202439生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024二、生物技術(shù)藥物制造過(guò)程的質(zhì)量控制（一）原材料的質(zhì)量控制原材料的質(zhì)量控制主要是對(duì)目的基因、表達(dá)載體及宿主細(xì)胞的檢查1．表達(dá)載體應(yīng)提供有關(guān)表達(dá)載體詳細(xì)資料，包括載體的生物學(xué)性質(zhì)和來(lái)源、構(gòu)建表達(dá)載體各組分的來(lái)源及性能，說(shuō)明載體的結(jié)構(gòu)、遺傳特性和抗生素抗性標(biāo)志物等。40生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20242．目的基因

目的基因，應(yīng)弄清其來(lái)源和克隆過(guò)程；加工過(guò)的基因應(yīng)說(shuō)明被修改過(guò)的密碼子、被切除的肽段及拼接的方法；使用PCR技術(shù)的，應(yīng)說(shuō)明擴(kuò)增模板、引物及酶反應(yīng)條件，并應(yīng)證明基因結(jié)構(gòu)正確無(wú)誤。

3.宿主細(xì)胞應(yīng)提供宿主細(xì)胞的資料，包括細(xì)胞株（系）名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及基本生物學(xué)特性等。

應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)應(yīng)提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性資料。

41生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024該步最關(guān)健的質(zhì)量控制在于保證基因的穩(wěn)定性、一致性和不被污染。1．主細(xì)胞庫(kù)（mastercellbank）

rDNA制品的生產(chǎn)應(yīng)采用種子批（seedlot）系統(tǒng)。從已建立的主細(xì)胞庫(kù)（MasterCellBank，MCB）中，再進(jìn)一步建立生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)（workingcellbank,WCB）。含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過(guò)克隆而建立主細(xì)胞庫(kù)。應(yīng)詳細(xì)記述種子材料的來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用壽命。應(yīng)提供在保存和復(fù)蘇條件下宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)。采用新的種子批時(shí)，應(yīng)重新作全面檢定。

（二）培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制42生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024對(duì)細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行全面的特性鑒定，包括細(xì)胞庫(kù)的來(lái)源、形式、貯藏、穩(wěn)定等。對(duì)細(xì)胞庫(kù)的質(zhì)量控制往往采用細(xì)胞學(xué)方法、表型鑒定、抗生素抗性檢測(cè)、限制性內(nèi)切酶圖譜測(cè)定、序列分析與穩(wěn)定性監(jiān)控等方法。

2.有限代次生產(chǎn)控制根據(jù)宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料，確定在生產(chǎn)過(guò)程中允許的最高細(xì)胞倍增數(shù)或傳代代次，應(yīng)確定廢棄批次培養(yǎng)物的指標(biāo)，并應(yīng)提供最適培養(yǎng)條件的詳細(xì)資料。在生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)的特性，例如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜。43生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20243.連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)控制

基本要求同有限代次生產(chǎn)，應(yīng)提供經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)后所表達(dá)基因的分子完整性資料，以及宿主細(xì)胞的表型和基因型特征。每批培養(yǎng)的產(chǎn)量變化應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi)。根據(jù)宿主/載體穩(wěn)定性及表達(dá)產(chǎn)物的恒定資料，應(yīng)規(guī)定連續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間。如屬長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)培養(yǎng)，應(yīng)根據(jù)宿主/載體穩(wěn)定性及產(chǎn)物特性的資料，在不同培養(yǎng)間隔時(shí)間作全面檢定。44生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024（三）純化過(guò)程的質(zhì)量控制常用分級(jí)沉淀、超濾、電泳、色譜等技術(shù)，以去除微量DNA、糖類(lèi)、殘余宿主蛋白、純化過(guò)程帶入的有害化學(xué)物質(zhì)、致熱原，或?qū)⑵錅p少至允許量。親和層析技術(shù)應(yīng)注意Ab(砹)從載體脫落而污染產(chǎn)物如真核細(xì)胞表達(dá)的制品反復(fù)多次使用，要求純度達(dá)98%以上；原核細(xì)胞表達(dá)的多次使用制品純度達(dá)95%以上即可；應(yīng)考慮純度、純化倍數(shù)、收率，應(yīng)盡量不加入對(duì)人體有害的物質(zhì)，若不得不加入，應(yīng)設(shè)法除凈，并在最終產(chǎn)物品中檢測(cè)殘留量，還要考慮到多次使用后的蓄積作用。45生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024(四)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制(1)生物學(xué)效價(jià)測(cè)定：應(yīng)盡量采用國(guó)際通用辦法，用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正，以動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)或體外細(xì)胞培養(yǎng)法法測(cè)定制品的生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位(如：1個(gè)酶活力單位是指在特定條件（25℃，其它為最適條件下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物中1微摩爾的有關(guān)基團(tuán)的酶量)。變異性較大，必須采用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌愤M(jìn)行校正。（2）純度測(cè)定：世界衛(wèi)生組織規(guī)定用非還原SDS和HPLC兩種方法測(cè)定，都應(yīng)達(dá)到95%以上，有些制品甚至要求達(dá)到99%。46生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024（3）藥物的比活性應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算出比活性，以活性單位/mg蛋白表示之，不僅是含量指標(biāo)，也是純度指標(biāo)。由于蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變，特別是二硫鍵的錯(cuò)配，可能影響到蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，而比活可以間接地反應(yīng)這一情況。（4）理化性質(zhì)鑒定A相對(duì)分子質(zhì)量：分子篩層析法，還原型SDS（±10%），質(zhì)譜B等電點(diǎn)測(cè)定：等電聚焦電泳法測(cè)定。重組藥物的等電點(diǎn)往往不均一，但是生產(chǎn)過(guò)程中批與批之間的電泳結(jié)果應(yīng)一致，以此控制生產(chǎn)工藝。C氨基酸成份分析：采用微量氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，包括甲硫氨酸，半胱氨酸及色氨酸的準(zhǔn)確值。結(jié)果應(yīng)為三次分別水解樣品測(cè)定后的平均值。在試生產(chǎn)的頭三批或改變工藝時(shí)必須檢測(cè)。

47生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024D部分氨基酸序列分析：中試前三批產(chǎn)品至少測(cè)N-端15個(gè)氨基酸；C-端1-3個(gè)AA序列

E肽譜分析：應(yīng)用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的產(chǎn)品片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽，應(yīng)用HPLC、SDS或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠巍２煌呐坞淖V應(yīng)一致，是工藝穩(wěn)定性的重要驗(yàn)證指標(biāo)。

F吸收光譜：對(duì)同一蛋白來(lái)說(shuō)，其最大吸收波長(zhǎng)是固定的，在生產(chǎn)過(guò)程中每批的紫外吸收光譜應(yīng)當(dāng)是一致。

G免疫原性：低免疫原性是衡量生物技術(shù)藥物的質(zhì)量高低的重要指標(biāo)。因?yàn)橛芍亟M生成的藥物，即使其氨基酸序列與天然蛋白質(zhì)一致，其免疫原性也可能由于空間結(jié)構(gòu)不同而高于天然提取的多肽藥物

F鑒別試驗(yàn)：將rDNA制品與天然產(chǎn)品通過(guò)生物學(xué)比較試驗(yàn)，確定其與天然產(chǎn)品是一致的48生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024（5）雜質(zhì)檢測(cè)A蛋白質(zhì)雜質(zhì)：視制造工藝而確定，可分為三大類(lèi)，來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)，來(lái)源于培養(yǎng)基，來(lái)源于下游生產(chǎn)工藝，如宿主蛋白，小牛血清，結(jié)構(gòu)相似的雜蛋白，產(chǎn)物降解或冷凍等產(chǎn)生的變構(gòu)體等。B非蛋白類(lèi)雜質(zhì)：主要有細(xì)菌、病毒、熱原質(zhì)和DNA等病毒和細(xì)菌等微生物比蛋白質(zhì)要大得多，可以采用各種過(guò)濾方法除去，終產(chǎn)品應(yīng)遵照中國(guó)生物制品規(guī)程進(jìn)行病毒污染檢查和無(wú)菌試驗(yàn)。熱原質(zhì)的檢查用注射家兔法或鱟（hou,甲殼類(lèi)動(dòng)物）試驗(yàn)法殘留DNA測(cè)定：DNA含量<100pg/劑量，通常采用核酸雜交或利用高親和力的DNA蛋白進(jìn)行測(cè)定，前者對(duì)針對(duì)有特異序列的DNA，而后者對(duì)所有序列的DNA都可以檢出。49生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制:參照現(xiàn)行國(guó)家藥典上同類(lèi)或相近產(chǎn)品,制訂出產(chǎn)品質(zhì)量檢定規(guī)程,并與國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局指定的藥品檢測(cè)機(jī)構(gòu)保持密切合作。在現(xiàn)行國(guó)家藥品法規(guī)制度下,確保產(chǎn)品安全有效,并考慮到放大生產(chǎn)時(shí)可能出現(xiàn)的問(wèn)題,導(dǎo)致產(chǎn)品檢測(cè)指標(biāo)產(chǎn)生差異的可能性，根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)情況制訂出合理的控制指標(biāo)并確定好相應(yīng)的檢測(cè)方法。在檢測(cè)項(xiàng)目中,如果現(xiàn)有藥典上的方法不能有效地進(jìn)行檢測(cè)時(shí),要與藥品檢測(cè)機(jī)構(gòu)的專(zhuān)家進(jìn)行有效的交流,提出合理的檢測(cè)方法或從國(guó)外相關(guān)藥典上選擇,并提供充分的試驗(yàn)數(shù)據(jù),使產(chǎn)品質(zhì)量檢定規(guī)程各項(xiàng)控制指標(biāo)切實(shí)可行。若要確定蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的均一性,還要對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行紫外光譜，圓二色譜，核磁共振，及熒光光譜分析等50生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/202451生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024第三節(jié)生物技術(shù)藥物的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)類(lèi)藥物因其分子具有嚴(yán)格的三維結(jié)構(gòu)，所以其生物活性不僅取決于其分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，還與其空間結(jié)構(gòu)的完整性密切相關(guān)。有兩個(gè)主要因素影響它們的穩(wěn)定性：①化學(xué)上的不穩(wěn)定性，由多種因素引起的對(duì)蛋白質(zhì)分子的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，引起原有化學(xué)鍵的斷裂或形成新的價(jià)鍵形式。主要有：氧化作用，脫酰胺作用，水解作用，外消旋作用，β-消去反應(yīng)等。②物理的不穩(wěn)定性。主要是涉及到更高級(jí)空間結(jié)構(gòu)的改變，包括蛋白質(zhì)分子二級(jí)或高級(jí)空間結(jié)構(gòu)的改變，這些改變的引起因素如：溫度，pH等蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的物理性或化學(xué)性的降解可能發(fā)生在多種不同環(huán)節(jié)，包括制造生產(chǎn)過(guò)程、純化操作過(guò)程、處方制劑及貯存流通使用過(guò)程。52生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/202453生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024

不穩(wěn)定氨基酸殘基的化學(xué)降解途徑不穩(wěn)定氨基酸殘基基本化學(xué)反應(yīng)Asn，Gln脫酰胺、外消旋作用、異構(gòu)化Asp水解作用、外消旋作用、異構(gòu)化Met，Cys氧化作用His，Trp，Tyrβ-消去反應(yīng)Ser，Thr，Cys外消旋化Cys二硫鍵交換54生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/2024一、生物技術(shù)藥物的化學(xué)穩(wěn)定性氨基酸的側(cè)鏈?zhǔn)遣环€(wěn)定性：Asn賴氨酸，Asp天冬氨酸，Cys半胱氨酸，Gln谷氨酰胺，His組氨酸，Lys賴氨酸，Met甲硫氨酸，Phe亮氨酸，Ser絲氨酸，Thr蘇氨酸，Trp色氨酸和Tyr絡(luò)氨酸等殘基的側(cè)鏈常易發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)，含不穩(wěn)定側(cè)鏈的氨基酸殘基常?？赏ㄟ^(guò)非酶促反應(yīng)，使共價(jià)鍵斷裂或?qū)Ψ肿舆M(jìn)行共價(jià)修飾。55生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20241、水解作用（1）一般酸、堿、蛋白酶的水解（2）-X-Asp天冬氨酸-Y，含有Asp殘基，在稀酸中更易水解（3）水解作用也常發(fā)生在蛋白質(zhì)的酰胺鍵，Asn賴氨酸,Gln谷氨酰胺。（4）N末端臨近Pro和Ser和Thr也易發(fā)生水解。蛋白質(zhì)水解后發(fā)生的質(zhì)量和大小變化可用HPLC，HPCE(高效毛細(xì)管電泳技術(shù))，SEC（尺寸排阻層析）進(jìn)行分析，用SDS及MS分析不同的水解片段。

56生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20242氧化作用主要原因有兩種：一是氧化劑的污染如在H2O2、多種過(guò)氧酸，N-氯代或溴代琥珀酰胺，過(guò)碘酸，碘等氧化劑的作用下；二是自身的自發(fā)氧化。Met、Cys、His、Trp、Tyr等最易氧化。含有Met和Cys殘基的側(cè)鏈極易發(fā)生氧化反應(yīng)。含有芳香族側(cè)鏈的氨基酸殘基如His、Trp、Tyr殘基的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物在純化與貯藏過(guò)程中也易發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致芳香環(huán)的破裂。蛋白質(zhì)的氧化作用還受到微量過(guò)渡金屬離子的催化，光照也可增加其氧化作用。氧分壓，溫度和緩沖液也對(duì)氧化作用有影響。發(fā)生氧化作用后的產(chǎn)品疏水性增加或極性增強(qiáng)，可用RP-HPLC分析，氧化產(chǎn)品比天然產(chǎn)品先洗脫下來(lái)。還可通HPCE，SEC（尺寸排阻層析），SDS分析。57生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20243脫酰胺作用只有兩種氨基酸Asn和Gln其側(cè)鏈含有酰胺鍵，因此只有含這兩種氨基酸殘基的蛋白質(zhì)才會(huì)發(fā)生脫酰胺作用。Asn和Gln可以水解生成羧酸和氨，同時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp和Glu，此反應(yīng)取決于環(huán)境的pH。提高pH、溫度和離子強(qiáng)度都可能增加脫酰胺作用。Asn-Gly具有最高脫酰胺速率，位于分子表面的酰胺基團(tuán)也比分子內(nèi)部的酰胺基團(tuán)易水解。脫酰胺后蛋白質(zhì)疏水性及極性發(fā)生變化，質(zhì)量減少電荷增加，因此可分別用反相，質(zhì)譜或NMR進(jìn)行分析58生物技術(shù)藥物的制造進(jìn)程課件5/9/20244消旋作用消旋作用是在一個(gè)以上的不對(duì)稱中心發(fā)生的構(gòu)型改變。蛋白質(zhì)的外消族作用是其L-氨基酸殘基轉(zhuǎn)化為D-氨基酸殘基，這種構(gòu)型的改變，并不改變蛋白質(zhì)的整體骨架結(jié)構(gòu)，但其分子的局部構(gòu)型已發(fā)生改變，整個(gè)分子的構(gòu)象也已改變，使側(cè)鏈與側(cè)鏈的相互作用發(fā)生變化。消旋作用的發(fā)生取決于堿催化α-碳質(zhì)子離子化成為負(fù)碳離子中間體，進(jìn)而使氨基酸由L型轉(zhuǎn)為D型。除甘氨酸外，堿催化消旋反應(yīng)對(duì)