DB37T 2038-2012 牛尿苷酸合酶缺乏癥(DUMPS)分子檢測技術(shù)規(guī)程　

DB37DB37/T2038—2012牛尿苷酸合酶缺乏癥（DUMPS）分子檢測技術(shù)規(guī)程Technicalspecificationofdetectionfordeficiencyofuridinemonophophatesynthaseinbovine2012-02-09發(fā)布2012-03-01實施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB/T6682-2008分析實驗室用NY/T1672-2008綿羊多胎主效基因FecB分子尿苷酸合酶缺乏癥deficiencyofuridinemonoph尿甘酸合酶缺乏癥是由于牛體內(nèi)尿苷酸合酶（UridineMonophophateSynthase，UMPS）基因的C-DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribo2尿甘酸合酶缺乏癥是由于奶牛體內(nèi)尿苷酸合酶（UMPS）基因的C-末端405處的密碼子存在一個點突胚胎早期死亡。基于這個點突變設(shè)計引物對該區(qū)域進行PCR擴增以及RFLP分析，由于野生型與突變型個除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-2008的雙蒸水下游引物：5'-GCTTCTAACTGAACTCCT3PCR擴增反應(yīng)總體積為20μL，其中10×PCRBuff0.5μL，10pmol/μL的上、下游引物各0.5μL，TaqDNA聚合酶1U，DNA模板100ng，加雙蒸水至20PCR擴增條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃終溶液澄清透明，室溫下冷卻至60℃左右時，加入溴化乙錠并混勻，使其終濃度為0.5μg/mL，即得1%2000bpDNAMarker作參45主要儀器設(shè)備A.2單道可調(diào)移液器：2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000A.5恒溫振蕩器：0r/min～200r/min，0℃~60℃6稱取SDS2g，加超純水18mL，加熱至68℃助溶，B.60.5mol/LEDTA(10mmol/LTris.Cl（pH8.0）、0.1mol/7﹪（B.1730﹪丙烯酰胺（49：1）丙烯酰胺147g和N，N′-亞甲雙丙烯酰胺3g溶解于400mL水中，將溶液加熱至37℃溶解，完全溶解后89C.7加入1mL75﹪的冰乙醇（-20℃)洗滌DNA沉淀2次，12000rpm、4℃離心3min。D.3加入等體積酚:氯仿:異戊醇(D.5取上清，加入2倍體積的無水乙醇（-20℃),沉淀DNA，12000rpm、4℃離心2min。D.6加入1ml75%的冰乙醇（-20℃)洗滌DNA2次。立即插入相應(yīng)的點樣梳，將膠板水平放置，室溫靜置20-60min以待凝膠聚合，在此過程中，添加