2025版高考生物二輪復(fù)習(xí)課件 課時(shí)4 突破基因工程類大題

突破基因工程類大題課

時(shí)4考情速覽熱點(diǎn)考情RT－RCR、實(shí)時(shí)熒光定量、PCR與反向PCR①2022·全國(guó)乙卷，38；②2022·江蘇卷，24；①2020·江蘇卷，33；②2020·山東卷，25PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)①2023·遼寧卷，25；①2021·天津卷，16熱點(diǎn)考情單酶切導(dǎo)致的正、反接的電泳檢測(cè)和PCR檢測(cè)①2024·黑吉遼卷，17、25；②2024·全國(guó)甲卷，38；③2024·河北卷，24；④2024·湖南卷，15；⑤2024·江西卷，12；⑥2024·浙江6月選考，19、20；①2023·山東卷，25；①2022·福建卷，13目

錄突破1基因工程的熱考題型PCR定點(diǎn)突變技術(shù)突破2突破1

基因工程的熱考題型題型一限制酶的選擇技巧(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)選擇限制酶①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。②為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點(diǎn)，如圖乙)(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)選擇限制酶(如圖)[例1]

(2024·巴蜀中學(xué)適應(yīng)考)科學(xué)家從大量木乃伊中獲得少量木乃伊DNA，進(jìn)行克隆，復(fù)制了2400年前的DNA。某生物興趣小組同學(xué)模擬了其中部分研究過(guò)程，設(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)(MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ為4種限制性內(nèi)切核酸酶，它們識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG)。請(qǐng)回答以下問(wèn)題：(1)從解旋過(guò)程進(jìn)行分析，PCR擴(kuò)增木乃伊基因與體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程不相同的地方是_______________________________________________________________________________________________________________________(答出兩點(diǎn))。(2)若將圖乙中質(zhì)粒和圖甲中木乃伊基因通過(guò)同種限制酶處理后，構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用的限制酶是________，選擇理由是__________________________________________________________________________________________________。 PCR擴(kuò)增是完全解旋后進(jìn)行復(fù)制，在高溫條件下解旋，不需要解旋酶，而體內(nèi)DNA復(fù)制是邊解旋邊復(fù)制，需要解旋酶解旋BamHⅠ

用BamHⅠ來(lái)切割目的基因和質(zhì)粒，切割后能保留完整的目的基因和標(biāo)記基因(合理即可)(3)經(jīng)檢測(cè)，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因不能正確表達(dá)，最可能的原因是__________________________________________________________。(4)據(jù)圖丙分析，培養(yǎng)基除了含有細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖必需的成分外，培養(yǎng)基A、B還應(yīng)分別含有______________。從檢測(cè)篩選的結(jié)果分析，含有目的基因的是___________菌落中的細(xì)菌。同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因與質(zhì)粒反向連接青霉素、四環(huán)素4和6解析

(1)PCR擴(kuò)增是完全解旋后進(jìn)行復(fù)制，在高溫條件下解旋，不需要解旋酶，而體內(nèi)DNA復(fù)制是邊解旋邊復(fù)制，需要解旋酶解旋。(2)能夠獲取目的基因并切開(kāi)質(zhì)粒的限制酶有識(shí)別序列為G↓GATCC的BamHⅠ和識(shí)別序列為↓GATC的MboⅠ，若使用MboⅠ會(huì)同時(shí)破壞質(zhì)粒中的青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，所以要用BamHⅠ來(lái)切割目的基因和質(zhì)粒，切割后保留了完整的青霉素抗性基因，便于篩選出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌。(3)因?yàn)槟康幕蚝洼d體是用同種限制酶切割的，同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因與質(zhì)粒反向連接，導(dǎo)致目的基因不能正確表達(dá)。(4)用限制酶BamHⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，但不會(huì)破壞青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能在含有青霉素的培養(yǎng)基上生存，但不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存。所以圖丙培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B還應(yīng)分別含有青霉素、四環(huán)素。從檢測(cè)篩選的結(jié)果分析，培養(yǎng)基A中含有菌落4和6，培養(yǎng)基B中不含菌落4和6，故含目的基因的是4和6菌落中的細(xì)菌。題型二PCR中引物的設(shè)計(jì)與選擇利用PCR擴(kuò)增目的基因(如干擾素基因)時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是有一段已知目的基因(干擾素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。(1)引物的作用：TaqDNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，TaqDNA聚合酶就能從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈。不同引物可結(jié)合不同的目的基因并進(jìn)行擴(kuò)增。(2)設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循的主要原則①引物長(zhǎng)度應(yīng)大于16個(gè)核苷酸，可防止隨機(jī)結(jié)合。②引物與靶序列間的Tm(指當(dāng)50%的引物和靶序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度)不應(yīng)過(guò)低。③引物不應(yīng)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即不能有4bp以上的回文序列。④2個(gè)引物間不應(yīng)有4bp以上的互補(bǔ)序列或同源序列。⑤引物中堿基的分布應(yīng)盡可能均勻，G＋C含量接近50%。(3)引物的處理由于引物延伸從3′端開(kāi)始，3′端不能進(jìn)行任何修飾，引物5′端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可給予修飾而不影響擴(kuò)增特異性。引物5′端修飾包括加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、熒光等。為了使經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的基因能與載體正常結(jié)合，需要在2種引物的5′端添加不同的限制酶的識(shí)別序列。其目的是保證目的基因定向插入載體并避免目的基因自身環(huán)化。(4)PCR循環(huán)時(shí)與引物相關(guān)的計(jì)算PCR經(jīng)過(guò)n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA數(shù)為2n，一共有2n＋1條鏈，其中有2條鏈?zhǔn)荄NA母鏈，不含引物，其他的每1條鏈均含1個(gè)引物，并且2種引物的數(shù)量相等，故PCR過(guò)程經(jīng)過(guò)n次循環(huán)，需要的引物總個(gè)數(shù)是2n＋1－2，需要某一種引物的總個(gè)數(shù)是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一個(gè)DNA由1條母鏈和第1種引物延伸的子鏈組成，另一個(gè)DNA由另1條母鏈和第2種引物延伸的子鏈組成，其他的DNA均由2種引物延伸的2條子鏈組成。[例2]

(2024·黑吉遼卷，25)將天然Ti質(zhì)粒改造成含有Vir基因的輔助質(zhì)粒(輔助T－DNA轉(zhuǎn)移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，可提高轉(zhuǎn)化效率。細(xì)菌和棉花對(duì)密碼子偏好不同，為提高翻譯效率，增強(qiáng)棉花抗病蟲害能力，進(jìn)行如下操作?；卮鹣铝袉?wèn)題。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是_________________________________。提取過(guò)程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是____________________________________________________。水解蛋白質(zhì)，使得DNA與蛋白質(zhì)分離

溶解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，析出不溶于酒精的DNA(2)本操作中獲取目的基因的方法是______________和________。(3)穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動(dòng)子，其作用是______________________________，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動(dòng)子，其目的可能是________________________________。PCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位提高目的基因的轉(zhuǎn)錄效率(4)根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用________基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。(5)為檢測(cè)棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是________和________。HygBRF3R2(6)本研究采用的部分生物技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程，理由是________(單選)。A.通過(guò)含有雙質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞B.將蘇云金桿菌Bt基因?qū)朊藁?xì)胞中表達(dá)C.將1～1362基因序列改變?yōu)槊藁?xì)胞偏好密碼子的基因序列D.用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列獲得改造的抗蟲蛋白D解析

(1)從蘇云金桿菌提取DNA時(shí)，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白質(zhì)，使得DNA與蛋白質(zhì)分離。提取過(guò)程中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷酒精，其目的是溶解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中獲取目的基因的方法是人工合成法和PCR技術(shù)擴(kuò)增法。(3)穿梭質(zhì)粒中p35s為啟動(dòng)子，其作用是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄；插入兩個(gè)p35s啟動(dòng)子，其目的可能是提高目的基因的轉(zhuǎn)錄效率。(4)結(jié)合基因表達(dá)載體的示意圖，根據(jù)圖中穿梭質(zhì)粒上的KanR和HygBR兩個(gè)標(biāo)記基因的位置，用HygBR基因?qū)?yīng)的抗生素初步篩選轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織。(5)為檢測(cè)棉花植株是否導(dǎo)入目的基因，提取棉花植株染色體DNA作模板，進(jìn)行PCR，應(yīng)選用的引物是F3和R2。(6)D項(xiàng)所述內(nèi)容制造了新的蛋白質(zhì)，屬于蛋白質(zhì)工程。突破2

PCR定點(diǎn)突變技術(shù)題型一重疊延伸PCR技術(shù)重疊延伸PCR技術(shù)其主要設(shè)計(jì)思路是用具有互補(bǔ)配對(duì)片段的引物(圖中的引物2和3，突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn))，分別進(jìn)行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。如某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖：題型二大引物PCR技術(shù)大引物PCR需要用到三條引物進(jìn)行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到不完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴(kuò)增得到完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段。原理如圖。題型三反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時(shí)，可采用反向PCR技術(shù)。原理是：用限制酶消化該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化，這樣就獲得了已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)相反方向的特異性引物，該引物對(duì)已知序列反向，但對(duì)未知序列卻是相向的，從而得以擴(kuò)增出未知序列。原理如圖。[例1]

(2024·廣東惠州調(diào)研)重疊延伸PCR技術(shù)是設(shè)計(jì)含突變點(diǎn)堿基的互補(bǔ)核苷酸片段的引物，在PCR過(guò)程中，互補(bǔ)的核苷酸片段形成重疊，重疊的部分互為模板，通過(guò)多次PCR擴(kuò)增，從而獲得突變基因的方法。科學(xué)家將枯草芽孢桿菌基因組上的甘油激酶編碼基因glpk的第270位氨基酸M突變?yōu)镮，構(gòu)建出了對(duì)甘油的利用水平大大提升的枯草芽孢桿菌，其原理如圖。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)含突變點(diǎn)堿基的互補(bǔ)核苷酸片段的引物是圖中的________。通過(guò)PCR1獲得產(chǎn)物AB需要進(jìn)行________次的PCR擴(kuò)增。(2)本實(shí)驗(yàn)獲得點(diǎn)突變的目的基因兩端為平末端，為便于構(gòu)建基因表達(dá)載體，需要將限制酶BamHⅠ和SalⅠ的識(shí)別序列分別引入誘變甘油激酶編碼基因的兩端，操作思路是____________________________________________________________________________________________________________。b和c3/三

將帶有BamHⅠ和SalⅠ的識(shí)別序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4DNA連接酶將其與突變產(chǎn)物的兩端相連接(3)獲取目的基因后，構(gòu)建質(zhì)粒載體，形成基因表達(dá)載體。基因表達(dá)載體上保證其能在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增的結(jié)構(gòu)是________，保證目的基因能正常轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)是______________________________。(4)對(duì)甘油激酶的改造屬于________工程的應(yīng)用，其第一步是____________________。復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子和終止子蛋白質(zhì)預(yù)期蛋白質(zhì)的功能解析

(1)根據(jù)題圖可知，含突變點(diǎn)堿基的互補(bǔ)核苷酸片段的引物是圖中的b和c；PCR過(guò)程是核苷酸鏈從5′端向3′端的延伸過(guò)程，從目標(biāo)DNA鏈中PCR出產(chǎn)物AB需要進(jìn)行3次PCR循環(huán)(第一次循環(huán)擴(kuò)增出來(lái)的新片段很長(zhǎng)很長(zhǎng)；第二次循環(huán)以新的長(zhǎng)片段為模板進(jìn)行，但新片段的一端是引物開(kāi)頭的，所以第二個(gè)循環(huán)得到的片段就是我們需要的長(zhǎng)度，但只是一條鏈，所以還不能分離出目的基因；第三次循環(huán)，當(dāng)以第二次循環(huán)得到的新片段為模板時(shí)，因?yàn)檫@個(gè)片段的長(zhǎng)度就是需要擴(kuò)增的長(zhǎng)度，當(dāng)?shù)谌窝h(huán)完成時(shí)，這個(gè)片段是需要的長(zhǎng)度，且是雙鏈DNA，這就得到了需要的目的基因了)。(2)將帶有BamHⅠ和SalⅠ的識(shí)別序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4DNA連接酶將其與突變產(chǎn)物的兩端相連接，可將限制酶BamHⅠ和SalⅠ的識(shí)別序列分別引入誘變甘油激酶編碼基因的兩端。(3)獲取目的基因后，可將其與質(zhì)粒重組。基因表達(dá)載體上保證其能在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增的結(jié)構(gòu)是復(fù)制原點(diǎn)，保證目的基因能正常轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)是啟動(dòng)子(RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出蛋白質(zhì))和終止子(位于基因的下游，也是一段特殊的DNA片段，功能：終止mRNA的轉(zhuǎn)錄)。(4)蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)改造或合成基因，來(lái)改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求，結(jié)合題意對(duì)甘油激酶的改造屬于蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用，其第一步是預(yù)期蛋白質(zhì)的功能。[例2]

(2024·南通一模)重疊延伸PCR定點(diǎn)突變過(guò)程分為兩步，如圖1。內(nèi)皮抑素能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的生成限制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究人員利用重疊延伸PCR定點(diǎn)突變技術(shù)將內(nèi)皮抑素基因endo改造為能進(jìn)入癌細(xì)胞并有較強(qiáng)抑癌作用的突變基因endo(m)，并再與抗Her2(人表皮生長(zhǎng)因子受體2)的納米抗體基因Dim形成融合基因Dim－endo(m)，導(dǎo)入大腸桿菌并表達(dá)，主要過(guò)程如圖2，其中KanR表示卡那霉素抗性基因，調(diào)節(jié)基因LacI的表達(dá)產(chǎn)物能和操縱基因LacO結(jié)合抑制基因的表達(dá)，IPTG能與LacI的表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。(1)圖1中PCR1和PCR2配制反應(yīng)體系時(shí)需加入不同的________。圖2中構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)使用的限制酶是________________。引物EcoRⅠ、HindⅢ(2)下列①～⑥是相關(guān)引物，其中突變1F為引物①，則突變1R、突變2F、突變2R分別為_(kāi)_______、________、________。①5′－GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC－3′②5′－CCGGAATTCCATATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC－3′③5′－GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAGCCACTGACGAGTCCGC－3′④5′－GTGGCATGGCTCGGACGCAAACGGGCGCAGGCTG－3′⑤5′－ATTTCTCGAGTTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG－3′⑥5′－CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCGAGCCATGCCAC－3′③④⑥(3)導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌由于調(diào)節(jié)基因LacI的表達(dá)產(chǎn)物能和操縱基因LacO結(jié)合，阻止________________酶的移動(dòng)，抑制Dim－endo(m)的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)到一定數(shù)量后在培養(yǎng)基中加入________________，使Dim－endo(m)持續(xù)表達(dá)。RNA聚合IPTG(4)研究表明，乳腺癌常出現(xiàn)Her2基因的高表達(dá)(不同乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)有差異)，因此Her2被認(rèn)為是乳腺癌檢測(cè)和治療的重要靶點(diǎn)。研究人員用不同濃度Dim－endo(m)融合蛋白處理乳腺癌細(xì)胞SKBR3、MDA231、MCF7和正常乳腺細(xì)胞HBL100作為實(shí)驗(yàn)組，選取正常培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞作為對(duì)照組，一段時(shí)間后分別測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)并計(jì)算抑制率，結(jié)果如圖所示，抑制率的計(jì)算公式是_____________________________________。Dim－endo(m)融合蛋白對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞的抑制率不同，其可能原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(1－實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù))×100%

不同乳腺癌細(xì)胞Her2基因的表達(dá)水平不同，進(jìn)入癌細(xì)胞的Dim－endo(m)融合蛋白的數(shù)量有差異；[Dim－endo(m)融合蛋白中的endo(m)對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞的殺傷力不同](5)納米抗體是傳統(tǒng)抗體的重鏈可變區(qū)片段，只有傳統(tǒng)抗體的1/10，但內(nèi)部存在更多的二硫鍵，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體的優(yōu)點(diǎn)是___________________________________________________________________。穿透力強(qiáng)，作用持久，免疫原性弱解析(1)DNA聚合酶要延伸DNA鏈，