DB37T 2307-2013 長(zhǎng)蛸(種質(zhì))　規(guī)范

ICS65.150B51DB37SpeciesidentificationofOctopusminor山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局IDB37/T2307—2013本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省海洋與漁業(yè)廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省漁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位：馬山集團(tuán)有限公司、中國(guó)海洋大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：鄭小東、王培亮、李琪、李開(kāi)鋒、錢耀森、于瑞海、左仔榮、常忠岳、崔玉龍。1DB37/T2307—2013長(zhǎng)蛸(種質(zhì))本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了長(zhǎng)蛸(Octopusminor(Sasaki,1920))的名稱與分類、主要生物學(xué)性狀、生長(zhǎng)與繁殖、遺傳特性及檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于長(zhǎng)蛸種質(zhì)檢測(cè)與鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18654.2養(yǎng)殖魚(yú)類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分:抽樣方法GB/T18654.13養(yǎng)殖魚(yú)類種質(zhì)檢驗(yàn)第13部分：同工酶電泳分析3名稱與分類3.1學(xué)名長(zhǎng)蛸Octopusminor(Sasaki,1920),Octopusvariabilis(Sasaki,1929)為其同物異名。3.2分類軟體動(dòng)物門（Mollusca），頭足綱（Cephalopoda），八腕目（Octopoda），蛸科（Octopodidae），蛸屬（Octopus）。4主要生物學(xué)性狀4.1外部形態(tài)特征4.1.1外形胴體長(zhǎng)卵形，胴長(zhǎng)約為胴寬的2倍；體表光滑，具極細(xì)的色素色斑。長(zhǎng)腕型，腕長(zhǎng)約為胴長(zhǎng)的6-7倍，各腕長(zhǎng)度不等，第一對(duì)腕最長(zhǎng)也最粗，其腕徑約為其他腕徑的兩倍，腕式為1＞2＞3＞4，腕吸盤兩行，基部為一行。雄性右側(cè)第3腕莖化，甚短，僅約為左側(cè)對(duì)應(yīng)腕長(zhǎng)度的二分之一；端器匙形，大而明顯，約為全腕長(zhǎng)度的六分之一。長(zhǎng)蛸外部形態(tài)見(jiàn)圖125.1生長(zhǎng)5.2繁殖5.2.1一年性成熟，繁殖期間有短距離洄游。5.2.3繁殖水溫：20℃~26℃,最適水溫22℃~24℃。5.2.4懷卵量：全長(zhǎng)540mm~560mm雌體，懷卵量80～140個(gè)左右。6遺傳特性3圖4長(zhǎng)蛸同工酶SOD酶譜圖6引物0M09擴(kuò)增長(zhǎng)蛸肌肉組織DNA的凝膠電泳圖譜4DB37/T2307—20137.2.2分析樣品的制備電泳前取0.3g樣品放入1.5ml離心管，加入等體積的提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合液置于冷凍離心機(jī)中，在4℃、12000rpm的條件下離心直至上清液澄清，取上清液冷凍保存?zhèn)潆娪居谩?.2.3凝膠制備加淀粉30g和制膠緩沖液254ml，在三角燒瓶?jī)?nèi)混勻，加熱至沸騰，抽氣，然后注入制膠模具中，冷卻后，保鮮膜密封保存?zhèn)溆谩?.2.4電泳步驟用手術(shù)刀在凝膠距離邊三分之一（約2.5cm）處切開(kāi)，用適當(dāng)大小的濾紙片蘸取樣品提取液放入切口中。上樣完畢后，用濾紙搭鹽橋，在4℃條件下以40mA穩(wěn)流進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間依酶的種類而不同。7.2.5染色、固定電泳結(jié)束后，用割膠弓將凝膠水平切割為1.3mm厚的薄片，置于染色盒中，將配制好的染色液倒入染色盒后置于37℃的恒溫箱中進(jìn)行染色。待酶顯示足夠的活性后，用10%的冰醋酸溶液終止反應(yīng)。各種酶的染色液見(jiàn)附錄C和附錄D。7.2.6制干膠片取凝膠放于大小合適的玻璃紙上，壓制封膜，風(fēng)干，編號(hào)保存。7.2.7攝影、掃描用近焦鏡頭對(duì)凝膠及其譜帶照相，或用掃描儀對(duì)干膠片電泳譜帶進(jìn)行掃描。7.2.8結(jié)果分析判定按GB/T18654.13的規(guī)定執(zhí)行。7.3微衛(wèi)星DNA分析7.3.1基因組DNA的提取取長(zhǎng)蛸肌肉0.1g，切碎至糜狀，加入500μlCTAB裂解液，加入20μlproteinK酶，混合入1.5ml的離心管，55℃裂解過(guò)夜。7.3.2引物序列引物序列見(jiàn)表17.3.3PCR反應(yīng)體系5DB37/T2307—201310μl體系組分見(jiàn)表2表210μl體系組分HO7.3.4PCR擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性3min,94℃變性1min,Ta（OM07：64℃;OM09：56℃)1min，退火30s,72℃延伸30s,38個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min。7.3.5聚丙烯凝膠酰胺電泳1000ml的聚丙烯凝膠酰胺膠液配方:尿素(mw60.06)420g，丙烯酰胺57g，N,N-甲叉3g，10×TBE120ml，滅菌雙蒸水定容至1000ml。PCR產(chǎn)物用6%的變性PAGE電泳，銀染顯色，冰醋酸固定，烘干以讀取數(shù)據(jù)。6DB37/T2307—2013（規(guī)范性附錄）制膠緩沖液的配制A.1CT-7.0制膠緩沖液三羥甲基氨基甲烷1.09g，用檸檬酸調(diào)至pH7.0，蒸餾水定容至1L。A.2CT-8.0制膠緩沖液三羥甲基氨基甲烷1.21g，用檸檬酸調(diào)至pH7.0，蒸餾水定容至1L。A.3CAPM-7.0制膠緩沖液檸檬酸0.42g，用3-氨甲基-嗎啡啉調(diào)至pH7.0，蒸餾水定容至1L。7DB37/T2307—2013（規(guī)范性附錄）電泳緩沖液配制B.1CT-7.0電泳緩沖液三羥甲基氨基甲烷16.35g，用檸檬酸調(diào)至pH7.0，蒸餾水定容至1L。B.2CT-8.0電泳緩沖液三羥甲基氨基甲烷20g，用檸檬酸調(diào)至pH8.0，蒸餾水定容至1L。B.3CAPM-7.0電泳緩沖液檸檬酸8.4g，用3-氨甲基-嗎啡啉調(diào)至pH7.0，蒸餾水定容至1L。8DB37/T2307—2013（規(guī)范性附錄）染色緩沖液配制C.10.2MTris-HCl,pH8.0三羥甲基氨基甲烷24.22g，用HCl調(diào)至pH8.0，蒸餾水稀釋至1L。C.20.2MTris-HCl,pH8.5三羥甲基氨基甲烷24.22g，用HCl調(diào)至pH8.5，蒸餾水稀釋至1L。C.30.1M磷酸緩沖液，pH7.0磷酸氫二鈉17.