微生物系列專題04微生物多樣性測序分析流程及常見結(jié)果解讀

?微生物多樣性分析流程及常見結(jié)果解讀解

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長知識(shí)金牌01常見分析結(jié)果解讀02CONTENTS課程目錄微生物多樣性測序基礎(chǔ)知識(shí)微生物多樣性測序基礎(chǔ)01解

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長知識(shí)金牌16S

rDNA是最常用的細(xì)菌分類標(biāo)準(zhǔn)。通過對指定環(huán)境中微生物16S

rDNA高變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，分析該環(huán)境下微生物群落的多樣性，包括物種的分類信息和豐度信息等。研究對象：特定環(huán)境中細(xì)菌或古細(xì)菌。16S

rDNA

的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)0

100

200

300

400

500

600

700

800V1V2V3V4V5V6V8V7V9900

1000

1100

1200

1300

1400

1500338F806R515F806R微生物多樣性測序簡介——16S

rRNA基因測序技術(shù)路線DNA抽提和質(zhì)檢PCR擴(kuò)增文庫構(gòu)建和質(zhì)檢Illumina

Miseq2X300bp測序數(shù)據(jù)分析解

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長知識(shí)金牌18S

rDNA/

ITS是常用的真菌分類標(biāo)準(zhǔn)，指定環(huán)境中真菌的高變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，反映不同樣本的物種間差異，分析該環(huán)境下微生物群落的多樣性，包括物種的分類信息和豐度信息等。研究對象：特定環(huán)境中真微生態(tài)落。18S

rDNA

的結(jié)構(gòu)ITS的結(jié)構(gòu)微生物多樣性測序簡介——18S

rRNA/ITS基因測序解

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長知識(shí)金牌分類注釋數(shù)據(jù)庫類常用軟件及數(shù)據(jù)庫分析軟件統(tǒng)計(jì)作圖軟件圖形編輯軟件解

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長知識(shí)金牌分類學(xué)注釋數(shù)據(jù)庫簡介數(shù)據(jù)庫名稱側(cè)重分類鏈接SILVABacteria，Achaea,

Eukarya16S/18S,

SSU，23S/28S,

LSUhttps://www.arb-silva.de/RDPBacteria，Achaea16S

rRNA（Bacterial

and

Archaeal）

,

and

28SrRNA（Fungal）/index.jspGreenGeneBacteria，Achaea16S

rRNA/

NCBItaxdmpBacteria，Achaea,

Eukarya,Virus/guide/taxonomy/UNITERoot-associated

fungiITShttps://unite.ut.ee/repository.phpPR2Eukarya18S/FunGenefunctional

genefunctional

geneeHOMDhuman

oral

microbiome

database/index.php解

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長知識(shí)金牌一般分析流程解

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長知識(shí)金牌Reads名稱測序得到的Reads序列Reads每個(gè)堿基的

質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以ASCII碼表示。Miseq

PE300測序序列說明Illumina平臺(tái)測序得到是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE

reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接（merge）成一條序列，同時(shí)對reads的種類和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣本得到有效序列。常見分析結(jié)果解讀02解

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長知識(shí)金牌OTU（OperationalTaxonomicUnits，操作分類單元）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志，是一個(gè)假定的運(yùn)算分類單元OTU

ID各樣本OTU數(shù)目各OTU物種分類OTU聚類與注釋分析-OTU及各分類學(xué)水平統(tǒng)計(jì)表解

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長金知

識(shí)

牌α-多樣性分析-多樣性指數(shù)分析群落生態(tài)學(xué)中通過單樣本的多樣性分析（α-多樣性）反映微生物群落的豐度和多樣性菌群豐度（Community

richness）指數(shù)：Chao;Ace菌群多樣性（Community

diversity）指數(shù)：Shannon;Simpson測序深度指數(shù)：Coverage樣本名稱分入所有OTU中的總優(yōu)化序列數(shù)本次實(shí)驗(yàn)該樣本優(yōu)化序列劃分得到的OTU數(shù)目相似性水平為0.97各個(gè)多樣性指數(shù)解

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長知識(shí)金牌α-多樣性分析-Shannon-Wiener曲線隨機(jī)取樣數(shù)Shannon-Wiener曲線：利用各樣本的測序量在不同測序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，足以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息統(tǒng)計(jì)學(xué)中的下限和上限值隨機(jī)抽取的測序數(shù)據(jù)量微生物多樣性指數(shù)解螺

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陪金知

識(shí)

牌α-多樣性分析-多樣性指數(shù)比較箱線圖多樣性指數(shù)比較箱線圖：不同分類或環(huán)境的多組樣本多樣性指數(shù)進(jìn)行四分位計(jì)算，比較不同樣本組的組間多樣性指數(shù)差異可同時(shí)采用非參數(shù)Mann-Whitney或Wilcoxon檢測判斷樣本組間差異的顯著性樣本分組伴醫(yī)生科研成長α-多樣性指數(shù)差異顯著性水平最大值四分位中位數(shù)四分位最小值解

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長知識(shí)金牌β-多樣性分析-PCA分析β多樣性是對不同樣本/不同組間樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析。主成分分析(Principal

Component

Analysis，PCA)：應(yīng)用方差分解對多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，從而提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)樣品群落組成越相似，PCA圖中樣品點(diǎn)間的距離越小不同顏色或形狀的點(diǎn)：不同環(huán)境或條件下的樣本組橫、縱軸刻度：相對距離，無實(shí)際意義PC1、PC2：對于兩組樣本微生物組成發(fā)生偏移的疑似影響因素解

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成長金知

識(shí)

牌β-多樣性分析-PCoA分析主坐標(biāo)分析（PrincipalCo-ordinatesAnalysis，PCoA）與PCA類似，通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)的一種降維排序方法基于Bray_Curtis、Weighted

Unifrac距離和Unweighted

Unifrac距離進(jìn)行PCoA分析，并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖展示樣品距離越接近，物種組成結(jié)構(gòu)越相似解

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|知識(shí)金牌PCA,PCOA（基于Bray_cutrtis,Unweighted

Unifrac,Weighted

Unifac）及Nmds分析的比較數(shù)據(jù)來源對照組、兩個(gè)不同時(shí)期的處理組。對于Con組，由于是背景完全一致的小鼠，故腸道菌群的類型是基本相同的（即菌的進(jìn)化關(guān)系較一致），Unweighted

UniFrac考慮物種的進(jìn)化關(guān)系及物種有無的變化，所以對于Con組，樣本間距離更近；而A組和B組樣本所用的處理方法比較劇烈，所以不論從菌的類型（菌的進(jìn)化關(guān)系）及豐度上均發(fā)生很大的改變，所以Bray_cutrtis,Unweighted

Unifrac兩種算法都能較好的區(qū)分。陪伴醫(yī)生科研成長解

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長知識(shí)金牌β-多樣性分析-Adonis多因素方差分析Adonis多因素方差分析：利用半度量（如Bray-Curtis)或度量距離矩陣(如Euclidean)對總方差進(jìn)行分解，分析不同分組因素對樣品差異的解釋度，并使用置換檢驗(yàn)對劃分的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行顯著性分析結(jié)合PCoA分析結(jié)果，用以判斷樣本分組是否有意義R2

-表示不同分組對樣品差異的解釋度，即分組方差與總方差的比值，即分組所能解釋的原始數(shù)據(jù)中差異的比例，R2越大表示分組對差異的解釋度越高Pr(>F)-通過置換檢驗(yàn)獲得的P值，P值越小，表明組間差異顯著性越強(qiáng)分組自由度總方差平均方差F檢驗(yàn)值不同分組對樣品差異的解釋度置換檢驗(yàn)P值解

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陪伴醫(yī)生科研成長知識(shí)金牌物種組成分析-優(yōu)勢物種相對豐度根據(jù)OTU注釋結(jié)果分別在各分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的物種相對豐度并作優(yōu)勢物種相對豐度圖，以反映微生物種類及其相對豐度根據(jù)各物種間spearman相關(guān)性距離進(jìn)行聚類根據(jù)Bray-Curtis距離算法進(jìn)行樣本聚類解

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長知識(shí)金牌樣本間差異分析-Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析（Wilcoxon

rank-sum

test）：曼-惠特尼U檢驗(yàn)（Mann–Whitney

U

test），能夠進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)通過對兩組樣本平均秩的研究實(shí)現(xiàn)判斷兩總體的分布是否存在差異，對兩組樣品的物種進(jìn)行顯著性差異分析，并對P值計(jì)算假發(fā)現(xiàn)率（FDR）q值平均相對

平豐度

度均相對豐 平均相對 平均相對豐標(biāo)準(zhǔn)差 豐度 度標(biāo)準(zhǔn)差

概率值 假發(fā)現(xiàn)率PH解

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長知識(shí)金牌樣本間差異分析-LEfSe線性判別分析LEfSe（LDA

Effect

Size）：用以發(fā)現(xiàn)基因、代謝和分類等高維生物標(biāo)識(shí)和揭示基因組特征，用于區(qū)別兩個(gè)或兩個(gè)以上生物條件或類群方法：通過non-parametric

factorial

Kruskal-Wallis(KW)sum-rank

test）檢測具有顯著豐度差異特征，并找到與豐度有顯著性差異的類群；線性判別分析（LDA）來估算每個(gè)組分（物種）豐度對差異效果影響的大小統(tǒng)計(jì)各個(gè)組中有顯著作用的微生物類群通過LDA分析（線性回歸分析）后獲得的LDA分值節(jié)點(diǎn)大小：豐度默認(rèn)從門到屬依次向外排列不同顏色區(qū)域：不同分組紅色節(jié)點(diǎn)：紅色組別中起到重要作用的微生物類群綠色節(jié)點(diǎn)：綠色組別中起到重要作用的微生物類群黃色節(jié)點(diǎn)：兩組中均沒有起到重要作用的微生物類群解

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長知識(shí)金牌RDA/CCA分析冗余分析（Redundancy

analysis，RDA）/典型相關(guān)分析（Canonicalcorrespondenceanalysis，CCA）主要用來反映環(huán)境因子、樣本、菌群三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系，其中RDA基于線性模型，CCA基于單峰模型數(shù)字：樣本名不同顏色或形狀：不同環(huán)境或條件下的樣本組箭頭：環(huán)境因子物種與環(huán)境因子間夾角：物種與環(huán)境因子間相關(guān)關(guān)系（銳角：正相關(guān)；鈍角：負(fù)相關(guān)；直角：無相關(guān)）不同樣本向各環(huán)境因子做垂線，投影點(diǎn)越相近說明樣本間該環(huán)境因子屬性值越相似，即環(huán)境因子對樣本的影響程度相當(dāng)解

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長知識(shí)金牌相關(guān)性分析Heatmap圖相關(guān)分析：用來分析變量之間的相關(guān)關(guān)系及其顯著性，相關(guān)性系數(shù)和顯著性P值可同時(shí)在Heatmap圖中展示（常見的如spearman相關(guān)性）色塊：相關(guān)性系數(shù)大小（范圍-1~1）***：P值小于0.01**：P值小于0.05,*：P值小于0.1解

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