第七章-發(fā)酵過(guò)程控制3-溫度

第六節(jié)溫度變化及其控制

一、溫度對(duì)生長(zhǎng)的影響1.不同微生物的生長(zhǎng)對(duì)溫度的要求不同，根據(jù)它們對(duì)溫度的要求大致可分為四類(lèi)：嗜冷菌適應(yīng)于0～200C生長(zhǎng)，嗜溫菌適應(yīng)于15～430C生長(zhǎng)，嗜熱菌適應(yīng)于37～650C生長(zhǎng)，嗜高溫菌適應(yīng)于650C以上生長(zhǎng)溫度變化及其控制2.每種微生物對(duì)溫度的要求可用最適溫度、最高溫度、最低溫度來(lái)表征。在最適溫度下，微生物生長(zhǎng)迅速；超過(guò)最高溫度微生物即受到抑制或死亡；在最低溫度范圍內(nèi)微生物尚能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度非常緩慢，世代時(shí)間無(wú)限延長(zhǎng)。溫度變化及其控制3.在最低和最高溫度之間，微生物的生長(zhǎng)速率隨溫度升高而增加，超過(guò)最適溫度后，隨溫度升高，生長(zhǎng)速率下降，最后停止生長(zhǎng)，引起死亡。4.微生物受高溫的傷害比低溫的傷害大，即超過(guò)最高溫度，微生物很快死亡；低于最低溫度，微生物代謝受到很大抑制，并不馬上死亡。這就是菌種保藏的原理。溫度變化及其控制1、微生物對(duì)溫度的要求不同與它們的膜結(jié)構(gòu)物理化學(xué)性質(zhì)有密切關(guān)系根據(jù)細(xì)胞膜的液體鑲嵌模型，細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下，膜中的脂質(zhì)成分應(yīng)保持液晶狀態(tài)，只有當(dāng)細(xì)胞膜處于液晶狀態(tài)，才能維持細(xì)胞的正常生理功能，使細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)微生物的生長(zhǎng)溫度與細(xì)胞膜的液晶溫度范圍相一致。二、微生物與溫度相關(guān)性的原理溫度變化及其控制液晶狀態(tài)：指某些有機(jī)物在發(fā)生固相到液相轉(zhuǎn)變時(shí)的過(guò)渡狀態(tài)。由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕B(tài)的溫度稱(chēng)為熔點(diǎn)，以T1表示；由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)的溫度稱(chēng)為清亮點(diǎn)，以T2表示。T1與T2之間的溫度稱(chēng)為液晶溫度范圍。那么為什么不同微生物對(duì)溫度的要求不同呢？根據(jù)細(xì)胞膜脂質(zhì)成分分析表明，具有不同最適生長(zhǎng)溫度的微生物，其膜內(nèi)磷脂組成有很大區(qū)別。嗜熱菌只含飽和脂肪酸，而嗜冷菌含有較高的不飽和脂肪酸。溫度變化及其控制2、與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)通過(guò)對(duì)嗜冷酶的蛋白質(zhì)模型和X-射線衍射分析表明，嗜冷酶分子間的作用力減弱，與溶劑的作用加強(qiáng)，酶結(jié)構(gòu)的柔韌性增加，使酶在低溫下容易結(jié)合底物底物進(jìn)行催化作用。溫度變化及其控制

嗜冷菌具有在0℃合成蛋白質(zhì)的能力。這是由于其核糖體、酶類(lèi)以及細(xì)胞中的可溶性因子等對(duì)低溫的適應(yīng)，蛋白質(zhì)翻譯的錯(cuò)誤率最低。許多中溫菌不能在O0C合成蛋白質(zhì)，一方面是由于其核糖體對(duì)低溫的不適應(yīng)，翻譯過(guò)程中不能形成有效的起始復(fù)合物，另一方面是由于低溫下細(xì)胞膜的破壞導(dǎo)致氨基酸等內(nèi)容物的泄露。3、與蛋白質(zhì)合成能力有關(guān)溫度變化及其控制4、合成冷休克蛋白低溫微生物適應(yīng)低溫的另一機(jī)制是合成冷休克蛋白將大腸桿菌從370C突然轉(zhuǎn)移到100C條件時(shí)細(xì)胞中會(huì)誘導(dǎo)合成一組冷休克蛋白，它們對(duì)低溫的生理適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，檢測(cè)嗜冷酵母的冷休克反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)冷刺激后冷休克蛋白在很短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生。耐冷菌由于生活在溫度波動(dòng)的環(huán)境中，它們必須忍受溫度的快速降低，這與它們產(chǎn)生的冷休克蛋白是密切相關(guān)的。溫度變化及其控制二、溫度的影響與控制（一）溫度對(duì)發(fā)酵的影響1、溫度影響微生物各種酶催化反應(yīng)速率發(fā)酵過(guò)程的反應(yīng)速率實(shí)際是酶反應(yīng)速率，酶反應(yīng)有一個(gè)最適溫度。阿累尼烏斯：d(lnK/dt)=△E/RT2

在生物學(xué)范圍內(nèi)溫度每升高10℃，生長(zhǎng)速度通常就加快一倍；溫度每升高10℃酶反應(yīng)速度增加2～3倍；溫度變化及其控制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的酶反應(yīng)溫度往往是不同的，因而發(fā)酵過(guò)程的溫度直接影響產(chǎn)率；青霉素溫度變化及其控制2、溫度影響發(fā)酵方向四環(huán)素產(chǎn)生菌金色鏈霉菌同時(shí)產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素，當(dāng)溫度低于300C時(shí)，這種菌合成金霉素能力較強(qiáng)；溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高，溫度達(dá)到350C時(shí)，金霉素的合成幾乎停止，只產(chǎn)生四環(huán)素。溫度還影響基質(zhì)溶解度，氧在發(fā)酵液中的溶解度，也影響菌對(duì)某些基質(zhì)的分解吸收。因此對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溫度要嚴(yán)格控制。溫度變化及其控制（二）最適溫度的選擇1、根據(jù)菌種及生長(zhǎng)階段選擇微生物種類(lèi)不同，所具有的酶系及其性質(zhì)不同，所要求的溫度范圍也不同。如黑曲霉生長(zhǎng)溫度為370C，谷氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌的生長(zhǎng)溫度為30～320C，青霉菌生長(zhǎng)溫度為300C。溫度變化及其控制在發(fā)酵前期由于菌量少，發(fā)酵目的是要盡快達(dá)到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長(zhǎng)迅速；在中期菌量已達(dá)到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長(zhǎng)中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲細(xì)胞衰老。因?yàn)樵谏缘蜏囟认掳被岷铣傻鞍踪|(zhì)和核酸的正常途徑關(guān)閉得比較嚴(yán)密，有利于產(chǎn)物合成。根據(jù)生長(zhǎng)階段選擇溫度變化及其控制發(fā)酵后期，產(chǎn)物合成能力降低，延長(zhǎng)發(fā)酵周期沒(méi)有必要，就又提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。如四環(huán)素生長(zhǎng)階段28℃，合成期26℃后期再升溫；黑曲霉生長(zhǎng)37℃，產(chǎn)糖化酶32～34℃。但也有的菌種產(chǎn)物形成比生長(zhǎng)溫度高。如谷氨酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)30～32℃，產(chǎn)酸34～37℃。最適溫度選擇要根據(jù)菌種與發(fā)酵階段做試驗(yàn)。溫度變化及其控制例：林可霉素發(fā)酵的變溫培養(yǎng)主要問(wèn)題：接種后10h左右已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在40h左右對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期基本完成，在50h左右轉(zhuǎn)入生產(chǎn)期如何維持適度的菌體濃度和延長(zhǎng)分泌期？適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度可以延緩菌體的衰老和維持相當(dāng)數(shù)量的有強(qiáng)生產(chǎn)能力的菌絲體存在溫度變化及其控制變溫培養(yǎng)的正交設(shè)計(jì)溫度變化及其控制溫度變化及其控制結(jié)論：前60h按31℃控制，縮短了對(duì)數(shù)期使發(fā)酵提前轉(zhuǎn)入生產(chǎn)階段，同時(shí)菌絲體已有相當(dāng)量的積累，為大量分泌抗生素提供了物質(zhì)基礎(chǔ)60小時(shí)后將罐溫降至3O℃使與抗生素合成有關(guān)的酶的活性增強(qiáng)，抗生素分泌量有所增加，同時(shí)溫度下降使分泌期的延長(zhǎng)有利于進(jìn)一步積累抗生素發(fā)酵進(jìn)入后期罐溫再回升至31℃使生產(chǎn)菌在發(fā)酵的最后階段最大限度的合成和排出次級(jí)代謝產(chǎn)物。溫度變化及其控制2、根據(jù)培養(yǎng)條件選擇溫度選擇還要根據(jù)培養(yǎng)條件綜合考慮，靈活選擇。通氣條件差時(shí)可適當(dāng)降低溫度，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可髙些。培養(yǎng)基稀薄時(shí)，溫度也該低些。因?yàn)闇囟雀郀I(yíng)養(yǎng)利用快，會(huì)使菌過(guò)早自溶。溫度變化及其控制3、根據(jù)菌生長(zhǎng)情況菌體生長(zhǎng)速度快，維持在較高溫度時(shí)間要短些；菌體生長(zhǎng)速度慢，維持較高溫度時(shí)間可長(zhǎng)些；培養(yǎng)條件適宜，如營(yíng)養(yǎng)豐富，通氣能滿足，那么前期溫度可髙些，以利于菌的生長(zhǎng)?？偟膩?lái)說(shuō)，溫度的選擇根據(jù)菌種生長(zhǎng)階段及培養(yǎng)條件綜合考慮。要通過(guò)反復(fù)實(shí)踐來(lái)定出最適溫度。溫度變化及其控制三、發(fā)酵過(guò)程引起溫度變化的因素（一）發(fā)酵熱Q發(fā)酵發(fā)酵熱是引起發(fā)酵過(guò)程溫度變化的原因。發(fā)酵熱：發(fā)酵過(guò)程中釋放出來(lái)的凈熱量。包括在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生菌分解基質(zhì)產(chǎn)生熱量（生物熱），機(jī)械攪拌產(chǎn)生熱量（攪拌熱），而罐壁散熱、水分蒸發(fā)、空氣排氣帶走熱量。這各種產(chǎn)生的熱量和各種散失的熱量的代數(shù)和就叫做凈熱量。發(fā)酵熱引起發(fā)酵液的溫度上升。溫度變化及其控制1、生物熱Q生物在發(fā)酵過(guò)程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供細(xì)胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余一部分以熱的形式散發(fā)出來(lái)，這散發(fā)出來(lái)的熱就叫生物熱。溫度變化及其控制生物熱與發(fā)酵類(lèi)型有關(guān)微生物進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多一摩爾葡萄糖徹底氧化成CO2和水好氧：產(chǎn)生287.2千焦耳熱量，

183千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?/p>

104.2千焦以熱的形式釋放厭氧：產(chǎn)生22.6千焦耳熱量，

9.6千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?/p>

13千焦以熱的形式釋放溫度變化及其控制

培養(yǎng)過(guò)程中生物熱的產(chǎn)生具有強(qiáng)烈的時(shí)間性。培養(yǎng)初期：菌體處于適應(yīng)期，菌數(shù)少，呼吸作用緩慢，產(chǎn)生熱量較少。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：菌體繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌體也較多，所以產(chǎn)生的熱量多，溫度上升快，必須注意控制溫度。培養(yǎng)后期：菌體已基本上停止繁殖，主要靠菌體內(nèi)的酶系進(jìn)行代謝作用，產(chǎn)生熱量不多，溫度變化不大，且逐漸減弱。如果培養(yǎng)前期溫度上升緩慢，說(shuō)明菌體代謝緩慢，發(fā)酵不正常。如果發(fā)酵前期溫度上升劇烈，有可能染菌，此外培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)越豐富，生物熱也越大。溫度變化及其控制2、攪拌熱Q攪拌在機(jī)械攪拌通氣發(fā)酵罐中，由于機(jī)械攪拌帶動(dòng)發(fā)酵液作機(jī)械運(yùn)動(dòng)，造成液體之間，液體與攪拌器等設(shè)備之間的摩擦，產(chǎn)生可觀的熱量。攪拌熱與攪拌軸功率有關(guān)，可用下式計(jì)算：

Q攪拌＝Pg×860×4186.8（焦耳/小時(shí)）

Pg——攪拌軸功率

4186.8——機(jī)械能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮艿臒峁Ξ?dāng)量溫度變化及其控制3、蒸發(fā)熱Q蒸發(fā)

通氣時(shí)，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)的熱量叫蒸發(fā)熱。此外，排氣也會(huì)帶走部分熱量叫顯熱Q顯熱，顯熱很小，一般可以忽略不計(jì)。4、輻射熱Q輻射發(fā)酵罐內(nèi)溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過(guò)罐體向外輻射。輻射熱的大小取決于罐溫與環(huán)境的溫差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超過(guò)發(fā)酵熱的5％。溫度變化及其控制Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射（二）發(fā)酵熱的測(cè)定有二種發(fā)酵熱測(cè)定的方法。一種是用冷卻水進(jìn)出口溫度差計(jì)算發(fā)酵熱。在工廠里，可以通過(guò)測(cè)量冷卻水進(jìn)出口的水溫，再?gòu)乃砩系弥啃r(shí)冷卻水流量來(lái)計(jì)算發(fā)酵熱。Q發(fā)酵＝GCm(T出－T進(jìn))Cm——水的比熱G——冷卻水流量另一種是根據(jù)罐溫上升速率來(lái)計(jì)算。先自控，讓發(fā)酵液達(dá)到某一溫度，然后停止加熱或冷卻，使罐溫自然上升或下降，根據(jù)罐溫變化的速率計(jì)算出發(fā)酵熱。溫度變化及其控制四、利用溫度控制提高產(chǎn)量例1

利用熱沖擊處理技術(shù)提高發(fā)酵甘油的產(chǎn)量背景：（1）酵母在比常規(guī)發(fā)酵溫度髙10～200C的溫度下經(jīng)受一段時(shí)間刺激后，胞內(nèi)海藻糖的含量顯著增加。（2）Lewis發(fā)現(xiàn)熱沖擊能提高細(xì)胞對(duì)滲透壓的耐受力（3）Toshiro發(fā)現(xiàn)熱沖擊可使胞內(nèi)3-磷酸甘油脫氫酶的活力提高15～25％，并導(dǎo)致甘油產(chǎn)量提高溫度變化及其控制實(shí)驗(yàn)：甘油發(fā)酵是在髙滲透壓環(huán)境中進(jìn)行的，因此可望通過(guò)熱沖擊來(lái)提高發(fā)酵甘油的產(chǎn)量正交條件A沖擊溫度（0C）40，45，50B開(kāi)始時(shí)機(jī)（h）8，16，30C沖擊時(shí)間（分）15，30，60結(jié)果發(fā)酵16小時(shí)，450C沖擊60分鐘最佳，發(fā)酵96小時(shí)后甘油濃度提高32.6％，發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)見(jiàn)下圖溫度變化及其控制溫度變化及其控制小結(jié)微生物生長(zhǎng)溫度微生物對(duì)溫度的要