第四章 抗體制藥part1課件

第四章抗體制藥第四章抗體制藥part1抗體？

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α（甲種球蛋白）、β（乙種球蛋白）、γ球蛋白（丙種球蛋白），并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。在相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)丙種球蛋白稱為抗體的同義詞。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1抗體？

抗體是指能與相應(yīng)特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白（Ig）。它是機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原物質(zhì)刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化、增值和分化為漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1抗原決定簇？

是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表團(tuán)，通常由5-7個(gè)氨基酸殘基或5-7個(gè)多糖殘基/核苷酸組成。抗原決定蔟是T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體和抗體識別結(jié)合的基本單位，他們之間的相互作用具有高度特異性。如：菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）等。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1多克隆抗體？

病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體，會給治療和診斷帶來誤差。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1單克隆抗體？1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體。他們將抗體產(chǎn)生細(xì)胞于具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系，此細(xì)胞系能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1單克隆抗體？由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1以單克隆抗體作為載體的藥物可對腫瘤進(jìn)行定向治療。但是，臨床應(yīng)用的實(shí)踐證明，免疫導(dǎo)向法并沒有成功，其障礙有：①單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人鼠抗體，加速了排斥反應(yīng)，在人體內(nèi)半衰期只有5~6h，難以維持有效藥物作用靶組織時(shí)間。②完整的抗體分子，即Ig的相對分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體腫瘤組織，達(dá)不到有效的治療濃度。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1基于上述原因，需從兩個(gè)方面對單克隆抗體加以改造：①降低單克隆抗體的免疫原性。②降低單克隆抗體的相對分子質(zhì)量。利用基因工程技術(shù)制備出基因工程抗體，即可達(dá)到上述目的。第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1單克隆抗體藥的現(xiàn)狀抗體藥的銷售額

97年~99年由4.68億美元增長到13億美元

03年抗體類藥物總銷售額將會達(dá)到50億美元250多種抗體類藥物在臨床試驗(yàn)中

1/3已進(jìn)入三期臨床

1/4已通過臨床三期試驗(yàn)美國市場上有種治療用的抗體藥物第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1單克隆抗體藥的現(xiàn)狀1994年，Centocor的Reopro一種血小板表面受體的單克隆抗體片段被批準(zhǔn)用于臨床來預(yù)防治療血栓形成1997年批準(zhǔn)上市的12種生物新藥中有2種是抗體藥1998年上市的12種新藥中有6種是抗體藥2000年又批準(zhǔn)了Mylotarg用于治療急性髓細(xì)胞白血病的抗CD33單克隆抗體2001年已批準(zhǔn)及預(yù)期會被批準(zhǔn)的10多種生物新藥中，也有5種是屬于抗體類藥第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1抗體藥物市場穩(wěn)步增長第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1全球有超過200家上市或未上市公司正在研發(fā)用于臨床診斷和治療的單克隆抗體正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的抗體公司（38家）第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1當(dāng)前美國治療性抗體市場第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1當(dāng)前美國治療性抗體市場第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1中國抗體研究現(xiàn)狀第一節(jié)概述第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備一、抗原與動(dòng)物免疫二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇三、篩選陽性克隆與克隆化四、雜交瘤細(xì)胞抗體形狀的鑒定五、單克隆抗體的大量制備六、單克隆抗體的純化第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備設(shè)計(jì)方案：一個(gè)B淋巴細(xì)胞----只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞----能無限增殖雜種細(xì)胞第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備㈠

雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵1.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性：

B淋巴細(xì)胞（Blymphocytes）：接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。

B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一點(diǎn)時(shí)間后便會死亡-----短命細(xì)胞第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備骨髓瘤細(xì)胞（myelomacells）：惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活-----長命細(xì)胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞-----沒有抗體分泌物。第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備2.細(xì)胞融合技術(shù)：

第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備3.雜交瘤細(xì)胞的篩選：

第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備一、抗原與動(dòng)物免疫第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備1.抗原

動(dòng)物體內(nèi)

抗體特異性差、純度低產(chǎn)量低，反應(yīng)不夠靈敏2.抗原

動(dòng)物體內(nèi)

抗體抗原不純

抗體不純篩選單一效應(yīng)B細(xì)胞不能增殖，產(chǎn)生大量抗體刺激效應(yīng)B刺激效應(yīng)B第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備動(dòng)物免疫:特定目標(biāo)抗原動(dòng)物脾臟中B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞大量繁殖免疫刺激能分泌針對于該抗原的特異性抗體目的：在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備常用免疫方法：

常規(guī)免疫法

“穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆”脾內(nèi)一次性免疫法

“省時(shí)；省抗原”

短程免疫法

“省時(shí)”

體外免疫法

“操作繁瑣”免疫途徑：皮下注射腹腔注射靜脈注射第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備常規(guī)免疫法：第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備脾內(nèi)免疫法：

脾內(nèi)免疫法即在麻醉?xiàng)l件下直接把0.1~0.2ml的抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。脾內(nèi)免疫法可提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)，節(jié)省抗原用量，細(xì)胞抗原只需105個(gè)左右，可溶性抗原只需10μg左右。第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備體外免疫法：

體外免疫法的優(yōu)點(diǎn)很多，所需抗原量少，一般只需幾微克，免疫期短，僅4~5天，干擾因素少，已成功的制備出針對多抗原的單克隆抗體，但融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株不夠穩(wěn)定。第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇細(xì)胞融合方法：

病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合

PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合電極融合第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備細(xì)胞懸液的制備與融合⑴

脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備⑵

骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：于對數(shù)生長期制備⑶細(xì)胞融合：5%PEG（1000~4000），pH8.0，38℃，1min

第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備2.HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基HT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基2weekslater1weeklater第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備三、篩選陽性克隆與克隆化常用方法：要求：簡便、快速、敏感；在短時(shí)間能檢測大量樣品

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，

ELISA）間接免疫熒光法（Indirectimmunofluorescence，IFA）

放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）雙向擴(kuò)散法第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)原理：第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備四、克隆化常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法

80個(gè)細(xì)/96孔飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercells）

ELISA法檢測單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備單克隆抗體（monoclonalantibody，MAb）由單一克隆的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體，只針對于一個(gè)抗原決定簇----單克隆抗體（monoclonalantibody，MAb）單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：高度純一高度專一應(yīng)用：

疾病的論斷和治療（生物導(dǎo)彈）生物大分子的鑒定、定位和分離純化細(xì)胞器的鑒定、定位和分離特定細(xì)胞或病毒的鑒定、定位很分離第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：動(dòng)物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)罐法第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備五、單克隆抗體的大量制備大量制備單克隆抗體的方法主要有兩種：

體外培養(yǎng)法：10μg/ml

動(dòng)物體內(nèi)誘生法：5~20mg/mlBALB/c小鼠優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體較多且效價(jià)較高。缺點(diǎn)：混有雜蛋白有血清培養(yǎng)法；無血清培養(yǎng)法第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備第四章抗體制藥part1第二節(jié)單克隆抗體及其制備動(dòng)