紫外-可見分光光度法

PAGEPAGE1第七章吸光光度法7.1概述7.1.1吸光光度法是基于被測物質(zhì)的分子對光具有選擇性吸收的特點而建立起來的分析方法，它包括比色分析法、可見及紫外吸收光度法以及紅外光譜法等。本章著重討論可見光區(qū)的吸光光度法（又稱分光光度法，簡稱光度法）。定義：基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立的分析方法稱為吸光光度法，包括比色法，可見分光光度法及紫外分光光度法等。比色分析法：許多物質(zhì)是有顏色的，例如高錳酸鉀在水溶液中呈深紫色，Cu2+在水溶液中呈藍色。這些有色溶液顏色的深淺與這些物質(zhì)的濃度有關(guān)。溶液愈濃，顏色愈深。因此，可以用比較顏色的深淺來測定物質(zhì)的濃度，這種測定方法就稱為比色分析法。目前已普遍地使用分光光度計進行比色分析。應(yīng)用分光光度計的分析方法稱為分光光度法。這種方法具有靈敏、準確、快速及選擇性好等特點。吸光光度法試液的濃度下限：10-510-6mol/L。吸光光度法測定的相對誤差：2%—5%，可以滿足微量組分測定對準確度的要求。7.1．2特點分光光度法同化學(xué)分析法中的滴定分析法、重量分析法相比，有以下特點：1.靈敏度高分光光度法測物質(zhì)的濃度下限（最低濃度）一般可達10-5~10-6mol/L，相當于含量低于0.001~0.0001%的微量組分。如果將被測組分加以富集，靈敏度還可提高1~2個數(shù)量級。該方法適用于微量組分的測定。2.準確度較高一般分光光度法的相對誤差為2~5%。3.操作簡便，測定速度快分光光度法的儀器設(shè)備不復(fù)雜，操作也簡便。如果采用靈敏度高，選擇性好的顯色劑，再采用掩蔽劑消除干擾，可以不經(jīng)分離直接測定，而且速度快。7.2基本原理7.2.1光的基本特性物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色與光有著密切的關(guān)系。光是一種電磁波，如果按照波長或頻率排列，則可得電磁波譜圖（四師P.275表10-1）。光具有兩象性：波動性和粒子性。波動性就是指光按波動形式傳播。例如：光的折射、衍射、偏振和干涉現(xiàn)象，就明顯地表現(xiàn)其波動性。λ·ν=c式中：λ—波長（cm）；ν—頻率（赫茲）；c—光速（≈3×1010光的粒子性：如光電效應(yīng)就明顯地表現(xiàn)其粒子性。光是由“光微粒子”（光量子或光子）所組成。光量子的能量與波長的關(guān)系為：E=hν=hc/λ式中：E—光量子的能量（爾格）；ν—頻率（赫茲）；h—普朗克常數(shù)（6.6262×10-34J·秒）.光色的互補關(guān)系首先要明確什么叫單色光、復(fù)合光、可見光。理論上將具有單一波長的光稱為單色光；由不同波長的光組合而成的光稱為復(fù)合光；人眼能感覺到的光稱為可見光（其波長范圍大約在400~750nm之間）。日光、白熾燈光等可見光都是復(fù)合光。如果讓一束白光（日光）通過棱鏡，于是發(fā)生折射作用，便分解為紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等顏色的光。（各色光之間沒有明顯的界限）。各種色光的近似波長（見課件）。反之，這些顏色的光按一定強度比例混合便能形成白光。如果把兩種適當顏色的單色光按一定強度比例混合后，就能得到白光。我們便稱這兩種單色光為互補色光。日光、白熾燈光等就是一對對互補色光按一定適當比例組合而成的?；パa色光的關(guān)系可用右圖表示。7．2.2.物質(zhì)對光的選擇吸收對固體物質(zhì)來說，當白光照射到物質(zhì)上時，如果物質(zhì)對各種波長的光完全吸收，則呈現(xiàn)黑色；如果完全反射，則呈現(xiàn)白色；如果對各種波長的光均勻吸收，則呈現(xiàn)灰色；如果選擇地吸收某些波長的光，則呈現(xiàn)反射或透射光的顏色。對溶液來說，溶液呈現(xiàn)不同的顏色是由于溶液中的質(zhì)點（離子或分子）對不同波長的光具有選擇性吸收而引起的。當白光通過某種溶液時，如果它選擇性地吸收了白光中某種色光，則溶液呈現(xiàn)透射光的顏色，也就是說，溶液呈現(xiàn)的是它吸收光的互補色光的顏色。例如：當一束白光通過硫氰酸鐵（Fe(SCN)3）溶液時，它選擇性地吸收了白光中的藍青色光，其它色光均透過溶液。銅銨絡(luò)離子的溶液因選擇地吸收了白光中的黃色光而呈現(xiàn)藍色。溶液呈現(xiàn)不同顏色乃是由于物質(zhì)對光的選擇吸收所造成的。當一束白光（強度為I0）通過下列幾種溶液，溶液呈現(xiàn)的顏色和吸收光的關(guān)系如下圖：如果將各種波長的單色光依次通過某一固定濃度的有色溶液，測定每一波長下有色溶液對光的吸收程度（即吸光度A），然后以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得一曲線，稱為吸收光譜曲線（簡稱吸收曲線）。是四個不同濃度KMnO4溶液的光吸收曲線。從圖上可以看到：⑴KMnO4溶液對不同波長的光吸收程度不同。⑵不同濃度KMnO4溶液的吸收曲線形狀相似，最大吸收波長不變。⑶同一物質(zhì)不同濃度的溶液，在一定波長處吸光度隨濃度增加而增大（這個特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)）。若在最大吸收波長處測定吸光度，靈敏度最高。7.2.3光吸收的基本定律—1、示意圖圖朗伯-比爾定律示意圖當一束平行單色光照射到任何均勻、非散射的介質(zhì)（固體、液體或氣體），例如溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被器皿的表面反射。如果入射光的強度為I0，吸收光的強度為Ia，透過光的強度為It，反射光的強度為Ir，則I0=Ia+It+Ir（1）在吸光光度法中，測量時都是采用同樣質(zhì)料的比色皿，反射光的強度基本上是不變的，其影響可以相互抵消，于是⑴式可簡化為：I0=Ia+It（2）透過光強度It與λ射光強度I0之比稱為透光度或透光率。用T表示。即⑶溶液的透光度愈大，說明對光的吸收愈??；相反，透光度愈小，則溶液對光的吸收愈大。實踐證明，溶液對光的吸收程度，與溶液的濃度、液層厚度以及入射光的波長等因素有關(guān)。如果保持入射光的波長不變，光吸收的程度則與溶液的濃度、液層厚度有關(guān)。（朗伯、比耳找出了它們的關(guān)系）2、朗伯定律當一束單色光通過溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的強度就要減弱。設(shè)入射光的強度為I0，透過濃度為c，液層厚度為b的溶液，透過光的強度為It，由于一部分光被吸收，所以It<I0，如果溶液的濃度保持不變，當液層越厚時，光在溶液中通過的路程越長，則光被溶液吸收的程度就越大，透過光的強度就越小。照射在薄層上的光強度為I，當光線通過該薄層后，被吸收的光強度（即減弱的光強度）該式表示當溶液濃度一定時，光的吸收與液層厚度的關(guān)系，稱為朗伯定律。A稱為吸光度（也稱光密度D或消光度E），該式說明了當溶液濃度一定時，光的吸收與液層厚度的關(guān)系，稱為朗伯定律。3、比耳定律對于液層厚度一定而濃度不同的溶液（即顏色深淺不同的溶液）來說，光的吸收是與溶液的濃度（C）及入射光的強度成正比，即入射光的強度減弱的情況與濃度固定而改變厚度的情況完全相似。如圖所示：如果用I表示透過光強度，則上式改為：或式中k4為比例常數(shù)，與入射光波長及溶液的性質(zhì)、溫度有關(guān)。比耳定律表明：當入射光的波長、液層厚度和溶液溫度一定時，溶液的吸光度與溶液的濃度成正比。4、朗伯-比爾定律表達式或者，其中透光度(透射光強度I與入射光強度I0之比)5、吸光系數(shù)、摩爾吸光系數(shù)和桑德爾靈敏度朗伯—比耳定律中的常數(shù)K值隨c、b所用單位不同而不同，有兩種表示方式。1.吸收系數(shù)a當濃度c的單位為g/L，液層厚度b用“cm”表示時，常數(shù)K以a表示，稱為吸光系數(shù)。單位為L/g·cm。此時，朗伯—比耳定律變?yōu)椋篈=a·b·c2.摩爾吸收系數(shù)κ當濃度c的單位為mol/L，液層厚度b用“cm”表示時，則K用另一符號κ表示。κ稱為摩爾吸光系數(shù)，單位為L/mol·cm。此時，朗伯—比耳定律為：A=κ·b·cκ表示濃度為1mol/L的有色溶液在1cm的比色皿中，在一定波長下溶液對光的吸收能力（即在一定波長下測得的吸光度數(shù)值）。它是每個有色化合物在一定波長下的特征常數(shù)，在比色分析中用它來衡量顯色反應(yīng)的靈敏度，κ值越大，則該顯色反應(yīng)越靈敏。例：已知含F(xiàn)e2+濃度為500微克/升的溶液，用鄰二氮菲比色測定鐵，比色皿長度為2cm，在波長508nm處測得吸光度A=0.19，計算摩爾吸光系數(shù)。解：Fe原子量為55.856偏離朗伯—比爾定律的原因1)工作曲線：根據(jù)朗伯-比爾定律，當波長和強度一定的人射光通過光程長度固定的有色溶液時，吸光度與有色溶液濃度成正比。通常在比色分析及可見光分光光度分析中，需要繪制標準曲線(工作曲線)，即在固定液層厚度及人射光的波長和強度的情況下，測定一系列不同濃度標準溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標作圖。這時應(yīng)得到一條通過原點的直線。該直線稱為標準曲線或工作曲線。在溶液濃度較高時，標準曲線不一定為直線。圖分光光度工作曲線2)非單色光引起的偏離。非單色光引起的偏離朗伯-比爾定律的基本假設(shè)條件是入射光為單色光。但目前儀器所提供的入射光實際上是由波長范圍較窄的光帶組成的復(fù)合光。由于物質(zhì)對不同波長光的吸收程度不同，因而引起了對比耳定律的偏離。3)化學(xué)因素引起的偏離。朗伯-比耳定律的基本假設(shè)，除要求入射光是單色光外，還假設(shè)吸收粒子是獨立的，彼此之間無相互作用，因此稀溶液能很好地服從該定律。在高濃度時(通常>0.01mol/L)由于吸收組分粒子間的平均距離減小，以致每個粒子都可影響其鄰近粒子的電荷分布，這種相互作用可使它們的吸光能力發(fā)生改變。一般認為比耳定律僅適用于稀溶液。7.3紫外－可見分光光度計7.3.1將使用光電比色計測定溶液的吸光度以進行定量分析的方法稱為光電比色法。將使用分光光度計進行測定的方法稱為分光光度法。兩種方法的測定原理是相同的，所不同的僅在于獲得單色光的方法不同，前者采用濾光片，后者采用棱鏡或光柵等單色器。由于兩者均基于吸光度的測定，所以它們統(tǒng)稱為光度分析法。光度計基本部件：光源、單色器、吸收池、檢測系統(tǒng)圖光度計的一般結(jié)構(gòu)圖721型分光光度計的構(gòu)造1、光源：在可見光區(qū)測量時通常使用鎢絲燈為光源。在近紫外區(qū)測定時常采用氫燈或氘燈產(chǎn)生180-375nm的連續(xù)光譜作為光源。2、單色器：濾光片-常用的濾光片由有色玻璃片制成，只允許和它顏色相同的光通過，得到的是近似的單色光。此外，還有一類利用光的干涉作用而產(chǎn)生相當窄的譜帶的干涉濾光片，它可提供小到10nm寬的譜帶和較大的透光度。棱鏡-光通過人射狹縫，經(jīng)透鏡以一定角度射到棱鏡上，在棱鏡的兩界面上發(fā)生折射而色散。色散了的光被聚焦在一個微微彎曲并帶有出射狹縫的表面上，移動棱鏡或移動出射狹縫的位置，就可使所需波長的光通過狹縫照射到試液上。3、吸收池(比色皿)比色皿，用于盛吸收試液，能透過所需光譜范圍內(nèi)的光線。在可見光區(qū)測定，可用無色透明、能耐腐蝕的玻璃比色皿，大多數(shù)儀器都配有液層厚度為0.5、1、2.5cm等的一套長方形或圓柱形比色皿。同樣厚度比色皿之間的透光率相差應(yīng)小4、檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)測量吸光度時，并非直接測量透過吸收池的光強度，而是將光強度轉(zhuǎn)換成電流進行測量，這種光電轉(zhuǎn)換器件稱為檢測器。因此，要求檢測器對測定波長范圍內(nèi)的光有快速、靈敏的響應(yīng)，最重要的是產(chǎn)生的光電流應(yīng)與照射于檢測器上的光強度成正比。光電比色計及可見光分光光度計常使用硒光電池或光電管作檢測器，采用檢流計作讀數(shù)裝置，兩者組成檢測系統(tǒng)。目視比色法用眼睛比較溶液顏色的深淺以測定物質(zhì)含量的方法，稱為目視比色法。目視比色法特點：目視比色法的主要缺點是準確度不高，如果待測液中存在第二種有色物質(zhì)，甚至?xí)o法進行測定。由于許多有色溶液顏色不穩(wěn)定，標準系列不能久存，經(jīng)常需在測定時配制，比較麻煩。但設(shè)備簡單，操作簡便，比色管內(nèi)液層厚使觀察顏色的靈敏度較高，且不要求有色溶液嚴格服從比耳定律，因而它廣泛應(yīng)用于準確度要求不高的常規(guī)分析中。7.4可見分光光度法一、顯色反應(yīng)及其條件的選擇㈠顯色反應(yīng)和顯色劑在分光光度分析中，很少利用金屬水合離子本身的顏色進行光度分析，因為它們的吸光系數(shù)值都很小。一般都是選適當?shù)脑噭?，首先利用顯色反應(yīng)把待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔铮缓筮M行測定。將待測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩衔锏姆磻?yīng)叫顯色反應(yīng)，與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。對顯色反應(yīng)的要求：①應(yīng)有較高的靈敏度與選擇性；②形成的有色配合物應(yīng)組成恒定、性質(zhì)穩(wěn)定；③顯色條件易于控制；④有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大。顯色劑主要分為無機顯色劑和有機顯色劑兩大類：1.無機顯色劑無機顯色劑在比色分析中應(yīng)用得并不很多，主要原因是生成的絡(luò)合物不夠穩(wěn)定；靈敏度和選擇性也不高。目前應(yīng)用較多的主要有硫氰酸鹽（測定Fe、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)、Nb等），鉬酸銨（測定Si、P、W等和過氧化氫（測定Ti(Ⅳ)）。2.有機顯色劑大多數(shù)有機顯色劑與金屬離子生成極其穩(wěn)定的螯合物，而且具有特征的顏色，因此，選擇性和靈敏度都較高。不少螯合物易溶于有機溶劑，可以進行萃取比色，這對進一步提高靈敏度和選擇性很有利。有機顯色劑大多是含有生色團和助色團的化合物。在有機化合物分子中，一些含有不飽和鍵的基團，它們能吸收大于200nm波長的光，這種基團稱為廣義的生色團。某些含有孤對電子的基團，它們與生色團上的不飽和鍵相互作用，可以影響有機化合物對光的吸收，使顏色加深，這些基團稱為助色團。有機顯色劑的種類極其繁多，簡單介紹了幾種：⑴鄰二氮菲屬于NN型螯合顯色劑，是目前測定Fe2+較好的試劑。⑵雙硫腙（即二苯硫腙）屬于含S的顯色劑，是分光光度分析中最重要的顯色劑，是目前萃取比色測定Cu2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+等很多重金屬離子的重要試劑。⑶二甲酚橙（縮寫為XO，結(jié)構(gòu)式三師P.325）二甲酚橙屬三苯甲烷顯色劑，是配位滴定中常用的指示劑，也是光度分析中良好的顯色劑。在酸性溶液中能與多種金屬離子生成紅色或紫紅色的配合物。⑷偶氮胂Ⅲ（又稱為鈾試劑Ⅲ）屬偶氮類螯合顯色劑。它可以在強酸性溶液中，與Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)、U(Ⅳ)等生成特別穩(wěn)定的有色絡(luò)合物。在此酸度下金屬離子的水解現(xiàn)象可不考慮，因而簡化了操作手續(xù)，提高了測定結(jié)果的重現(xiàn)性和可靠性。目前偶氮胂Ⅲ已廣泛用于礦石中鈾、釷、鋯以及鋼鐵和各種合金中稀土元素的測定。⑸鉻天藍S（也稱鉻天菁S，簡稱為CAS）屬于三苯甲烷類螯合顯色劑，是測量鋁的很好試劑。㈡影響顯色反應(yīng)的因素1.顯色劑用量生成有色配合物的顯色反應(yīng)一般可用下式表示：對穩(wěn)定性較高的配合物，只要加入稍過量的試劑，顯色反應(yīng)即能定量進行。對于有些顯色反應(yīng),顯色劑如果加入太多，有時反而會引起副反應(yīng)，對測定不利。必須嚴格控制試劑的用量。例如：以SCN-作顯色劑測定鉬時，是要求生成紅色的Mo(SCN)5配合物，當SCN-濃度過高時，可生成淺紅色的Mo(SCN)6-配合物，反而使其吸光度降低。Mo(SCN)32+Mo(SCN)5Mo(SCN)6-(淺紅)(橙紅)(淺紅)而以SCN-作顯色劑測定Fe3+時，隨SCN-濃度增大，逐步生成顏色更深的不同配位數(shù)的配合物，使吸光度值增大。對上述兩種情況，就必須嚴格控制顯色劑的用量，才能得到準確的結(jié)果。在實際工作中，通常根據(jù)實驗結(jié)果來確定顯色劑的用量。通常有下列三種情況：⑴該曲線較常見。⑵該曲線與第一種曲線不同的地方是曲線的平坦區(qū)域較窄。⑶該曲線與前兩種情況完全不同。2.溶液的酸度酸度對顯色反應(yīng)的影響主要有以下幾方面：⑴影響顯色劑的濃度和顏色Me++HRMeR+H+⑵影響被測金屬離子的存在狀態(tài)Al(H2O)63+Al(H2O)5OH2++H+2Al(H2O)5OH2+Al2(H2O)6(OH)33+⑶影響配合物的組成對于某些生成逐級配合物的顯色反應(yīng)，酸度不同，配合物的配位比不同，其色調(diào)也不同。例如：磺基水揚酸與Fe3+的顯色反應(yīng)，在不同酸度條件下，可能生成1∶1，1∶2，1∶3三種顏色不同的配合物，故測定時應(yīng)控制溶液的酸度。3.顯色時間不同的顯色反應(yīng)顏色達到最大的吸收強度所需時間是不同的，而且保持顏色穩(wěn)定的時間范圍也是不同的。所以，為了測得準確的結(jié)果，應(yīng)在保持顏色穩(wěn)定的時間內(nèi)測定吸光度。4.溫度的影響顯色反應(yīng)的進行與溫度有很大關(guān)系。一般顯色反應(yīng)可在室溫下完成。但是有的在室溫下進行得很慢，需要加熱促使反應(yīng)迅速完成。有的顯色反應(yīng)所形成的配合物在溫度高時發(fā)生分解或褪色。有的需放置一段時間才能使反應(yīng)進行完全。顯然，對于不同的顯色反應(yīng)，應(yīng)選擇適宜的溫度進行反應(yīng)，使反應(yīng)能進行完全。同樣，標樣和試樣顯色時，其溫度應(yīng)很近似，以減小其誤差。5.溶劑的影響有機溶劑會降低有色化合物的離解度，從而提高顯色反應(yīng)的靈敏度。同時，有機溶劑還可能提高顯色反應(yīng)的速度以及影響有色配合物的溶解度和組成。6.干擾離子的影響干擾離子的存在對光度測定的影響大致有以下三種情況：⑴干擾離子本身有顏色，在被測物所選用的波長附近有明顯的光吸收，但不因加入試劑而改變。⑵干擾離子（不論本身有無顏色）能與顯色劑生成有色化合物。⑶干擾離子阻止被測離子與顯色劑的反應(yīng)，致使顯色反應(yīng)進行不徹底，而產(chǎn)生負干擾。消除干擾作用一般有以下幾種方法：①控制酸度②選擇適當?shù)难诒蝿劾蒙啥栊越j(luò)合物④選擇適當?shù)臏y量波長⑤選用適當?shù)膮⒈热芤孩薹蛛x二、吸光光度法的測量誤差及測量條件的選擇㈠儀器測量誤差對給定的光度計，透光度與吸光度的讀數(shù)誤差是衡量測定結(jié)果的主要因素。對于一給定的光度計，透光度讀數(shù)誤差△T基本是一常數(shù)，約為0.01~0.02。但是當透光度（T）不同時，同樣大小的△T所引起的濃度誤差△C是不同的，這可從透光度與濃度的關(guān)系圖或相對誤差與透光度的關(guān)系圖中可看到。如：T%=10~20%時（△T=10），△A≈0.3；T%=80~90%時（△T=10），△A≈0.05?？梢钥闯觯珹值越大，△T引起的△A就越大。當T=0.368時（即A=0.434），測量誤差最小。在T=20~65%（即A=0.2~0.7）范圍內(nèi)，濃度測量的相對誤差較小。透光度T太小或太大，誤差會急