腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)課件

腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)

腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)Histroy腫瘤類型：間充質(zhì)上皮神經(jīng)外胚層

造血源性（1955-1958-1963-1965）Invitro:原代傳代建系（1967-1970）配基成分：純血清含血清無血清生物學(xué)特性：細胞亞細胞酶和分子腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)腫瘤細胞invitro的特點細胞保持永生性：自我復(fù)制形態(tài)學(xué)：大小不一

逐漸一致增殖力更強：DNA合成期、分裂期達50%突變性：不同于正常細胞，失去穩(wěn)定的控制高分化變低分化表面性狀：負電荷數(shù)量>正常，貼壁性，抗原性可變異接觸抑制減弱或消失：懸浮生長特征：成瘤性：移植到動物體內(nèi)可成瘤腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)腫瘤細胞invitro培基RPMI1640：最常用，+10~20%FCS，上皮性或懸浮性（+0.03%谷氨酰胺）DMEM：常用F12：適用于上皮性癌，如肝癌，L-15：

注意：+2g/LNaHco3或

+20mmol/LHEPESpH7.2RPMI1640+F12或L-15（1:1）：適用肉瘤腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)液特殊添加劑

常用的促細胞生長因子及使用的終濃度添加劑終濃度添加劑終濃度

BSA10-5mol/mlEGF5ng/mltransferrin5-10g/mlFGF5ng/mlinsulin5pg/mlNGF5ng/ml

氫化可的松10-5mol/ml腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)腫瘤細胞的培養(yǎng)與常規(guī)細胞培養(yǎng)技術(shù)相同一個細胞群體，存在多種亞群，復(fù)雜性建株細胞較正常細胞易于培養(yǎng)腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞分裂增殖的調(diào)控

（細胞周期）多種基因的協(xié)同作用調(diào)控因子：基因：Cdc2、cyclin

蛋白磷酸化蛋白激酶的調(diào)控胸苷激酶的調(diào)控負調(diào)：DNA損傷與DNA修復(fù)：抑制抗性腫瘤細胞

腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞間的相互影響不同亞群代表不同分化程度的細胞群表型、形態(tài)、受體、對因子的反應(yīng)等均不同不同亞群釋放不同的正負調(diào)節(jié)因子

(陰陽調(diào)控)腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞因子與激素對腫瘤細胞的調(diào)控一個重要而復(fù)雜的因素

因素高分化低分化——————————————————胰島素生長-凝血孝素生長-前列腺素促進（>400)抑制激情素-助黏附維生素A抑制生長及分化____________________________________調(diào)整培基中的成分可調(diào)控細胞的生長與分化腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)影響培養(yǎng)腫瘤細胞生長的因素PH營養(yǎng)：如血清效價低細胞生長因子的自分泌及旁分泌癌基因抑癌基因的變化排泄廢物的影響細胞外基質(zhì)的作用細胞相互間的作用污染腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)-取材手術(shù)標本活檢標本胸腹水穿刺細針頭穿刺內(nèi)窺鏡活檢

關(guān)鍵：新鮮、無菌、及時、準確腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)技術(shù)-分離純化分離：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等密度沉降分離純化：反復(fù)貼壁去除成纖維細胞自然淘汰去除正常細胞利用特異抗原標志篩選法(panning)分亞型流式細胞儀分選克隆建株高轉(zhuǎn)移株的建立：反復(fù)接種腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)技術(shù)-培養(yǎng)原代培養(yǎng)：去除纖維細胞及淋巴細胞，防止細菌、真菌污染。傳代培養(yǎng)：增殖力低的細胞需要飼養(yǎng)細胞適當密度,基本長滿后傳代,前10代不穩(wěn)定，注意培養(yǎng)條件，適當調(diào)整培基。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)技術(shù)-鑒定與建株鑒定：組織來源、形態(tài)特征、核型染色體分析、生長特性、對細胞因子的反應(yīng)（TNF)、集落形成、致瘤實驗（裸小鼠）建株：生長半年以上，病理診斷、光鏡及電鏡觀察、生長特征、染色體分析、腫瘤標志、致瘤及轉(zhuǎn)移情況注意：不是每一腫瘤組織都能建株腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用-腫瘤治療的研究治療藥物敏感性的鑒定與篩選腫瘤的多藥耐藥性的鑒定各種新藥治療的實驗研究體外：腫瘤的生長（3HTdr摻入）腫瘤的殺傷率（MTT、51Cr釋放）體內(nèi)：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤生長率、轉(zhuǎn)移率、生存時間及死亡率

作用機理的研究：基因、蛋白、酶、標志、受體腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)腫瘤細胞培養(yǎng)的應(yīng)用腫瘤細胞的遺傳特性：各種癌基因及抑癌基因的分析、染色體定位（FISH法）腫瘤細胞的生物學(xué)行為：細胞周期（FACS)、信號傳遞腫瘤細胞的標志與激素、受體變化（免疫細胞化學(xué)、放射自顯影、酶免疫、熒光免疫、放射免疫、免疫印跡）腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備

基本原理：Bunet抗體選擇學(xué)說，每個B細胞只能夠產(chǎn)生一種針對它的特異性抗原決定簇的抗體。從一個祖先B細胞分裂繁殖形成的純細胞系，稱為克隆。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備

單克隆抗體定義：來自克隆系的細胞基因完全相同，產(chǎn)生的抗體完全相同。這種從一株克隆系產(chǎn)生的抗體—

單克隆抗體（McAb)。

1975年Kohler和

Milstein首先利用細胞融合技術(shù)制備了永久分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備特點：

腫瘤細胞易體外培養(yǎng)和長期生長；

B淋巴細胞分泌特異性抗體；

二者雜交融合雜交瘤，繼承二者性質(zhì)。

HAT培基：H—次黃嘌呤、

A—氨基蝶呤

T—胸腺嘧啶核苷

腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備腫瘤細胞DNA合成途徑：

葉酸衍生物

氨基酸、小分子化合物合成DNA

HGPRT-TK

次黃鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶胸腺嘧啶核苷激酶

核苷酸前體腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備HAT特點：“A”—葉酸拮抗物骨髓瘤-骨髓瘤：DNA合成途徑阻斷；缺HGPRT，不能利用“H”—死亡。脾細胞-脾細胞：有HGPRT，缺增殖能力—死亡。骨髓瘤-脾細胞：HGPRT+無限增殖能力—

存活。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備方法抗原：純度、分子量。1.

細胞1~21072.可溶性蛋白質(zhì)抗原10~100μg動物：BALB/C鼠，周齡：6~8周，雌性佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、脂質(zhì)體腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)免疫方法1.常規(guī)免疫：腹腔或頸部多點皮下

0天：基礎(chǔ)免疫—抗原+完全佐劑

15天：基礎(chǔ)免疫—抗原+不完全佐劑

30天：基礎(chǔ)免疫—抗原+不完全佐劑

45天：追加免疫—同量抗原

48天：進行細胞融合

腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)免疫方法備注：1.細胞、細菌、病毒等顆粒性抗原有較強抗原性，可不加佐劑，直接腹腔注射。2.可溶性蛋白質(zhì)抗原需加佐劑。本研究室經(jīng)驗：腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)免疫方法2.脾內(nèi)免疫：2.10天：基礎(chǔ)免疫

15天：脾內(nèi)免疫

18天：細胞融合2.20天：脾內(nèi)免疫

4天：細胞融合腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)免疫方法脾內(nèi)免疫優(yōu)點：時間短，使用抗原量少?？扇苄钥乖?~10g

細胞抗原：1105缺點：效果差于常規(guī)免疫，尤其無基礎(chǔ)免疫的脾內(nèi)免疫。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)免疫方法脾內(nèi)免疫方法：

BALB/C小鼠乙醚麻醉，右臥位，消毒，無菌操作剪開皮膚，透過腹膜，用4號針頭注射器注入脾臟，盡量刺深，勿刺透，縱軸方向，邊退邊注射或多點注射。注意事項：抗原體積

0.2ml，脾內(nèi)逐步注射后，針頭拔出口時要停留片刻，縫合切口或用醫(yī)用黏合劑涂抹切口。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)免疫方法3.弱免疫原免疫方案；

0天：基礎(chǔ)免疫

30天：基礎(chǔ)免疫

45天：基礎(chǔ)免疫

60天：基礎(chǔ)免疫

75天：基礎(chǔ)免疫

6個月內(nèi)，至鼠血清測出抗體產(chǎn)生。靜脈或脾內(nèi)追加免疫后72~96h細胞融合。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)免疫方法4.體外免疫：分離小鼠脾細胞，置10%~20%FCSRPMI1640培基，加適量滋養(yǎng)細胞與抗原（可溶性抗原0.5~5g/ml；細胞性抗原105~106/ml），37℃，5%CO2培養(yǎng)3天，再分離淋巴細胞與骨髓瘤細胞，融合。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備一.滋養(yǎng)細胞制備：1.機制：不明，通常認為這類細胞釋放一種或幾種生長因子，提供必要生長條件。2.小鼠腹腔巨噬細胞制備滋養(yǎng)細胞⑴正常無感染BALB/C小鼠，處死。⑵75%乙醇浸泡5~10min，腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備⑶

撕開腹部皮膚，充分暴露腹腔，提起腹膜，剪開，吸管注入5ml無血清培基，小心提動或輕揉腹膜，吸出培基。⑷無血清培基洗2次，細胞濃度2×105/ml,0.1ml/孔/96孔，相當于2×104。通常獲2×106~5×106只。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備二.骨髓瘤細胞準備：Sp2/0,NS-1等1.

復(fù)蘇，20%FCSRPMI-1640培基為好。2.

培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期細胞（1×105~5×105/ml），按1：5~1：10

稀釋傳代，2、3天擴大培養(yǎng)，選生長狀態(tài)、形態(tài)好對數(shù)生長期細胞融合用。3.RPMI-1640培基洗3次（1000r/min×5min)腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備注意事項：1.

骨髓瘤細胞的細胞活數(shù)應(yīng)在〉95%，2.

無各種污染，3.骨髓瘤細胞質(zhì)量保證、生長密度合適。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備三.免疫脾細胞懸液制備：1.免疫BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。2.浸泡于75%乙醇5~15分，入超凈臺，打開腹腔（逐次換器械），取脾。3.

剪碎脾臟，注射器內(nèi)芯研磨過100目鋼篩，平皿預(yù)先2~3mlRPMI-1640，移入圓底試管，補加適量培基，，靜置3~5分，取上2/3懸液移入50ml離心管，上述反復(fù)2~3次。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備三.免疫脾細胞懸液制備：5.

上述培基洗細胞2次（1000r/min×10min），6.

不完全培基10ml重懸液，臺盼藍計數(shù)活脾細胞數(shù)，1×108~2.5×108/只。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備四.50%PEG的準備：

融合前，稱PEG（mw=4000)2g，置小瓶內(nèi)，低壓消毒（8磅），15min,取出立即邊加邊搖加入2ml完全培基，（內(nèi)含0.3%ml二甲基亞楓，以提高融合率），至完全混合，4

℃保存。用前37℃預(yù)熱。要求PEG現(xiàn)配，防止PH變堿。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備五.細胞融合：1.

將準備好的骨髓瘤細胞與脾細胞混合于

50ml離心管內(nèi)（脾細胞1×108，骨髓瘤細胞1×107）。用SP2/0時，脾細胞：骨髓瘤細胞以10：1為好；用NS-1，脾細胞：骨髓瘤細胞以5：1為好。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備2.RPMI-1640培基洗2次（1500r/min/8min）；3.

傾倒上清，吸盡殘留液，輕彈管底，使細胞疏松，離心管移至超凈臺預(yù)先放置的37℃水浴。4.1ml吸管吸取0.8ml37℃PEG，1×108

脾細胞+0.8mlPEG，邊加邊搖，60s內(nèi)加完，輕搖1.5min。5

min內(nèi)搖動緩和加入10ml預(yù)溫37

℃的RPMI-1640。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備注意：

第1min加1ml;

第2min加1ml;

第3min加1.5ml;

第4min加1.5ml;

第5min加5ml;再補加40ml。離心：1000r/min/5min.腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備5.移出上清，取少量HAT小心吹散細胞，細胞移入HAT培基中，按免疫脾細胞2×105

/孔/96孔，加入0.1ml~0.2ml/孔（已加入融合當天制備的滋養(yǎng)細胞），CO2

孵箱37℃。提示：接種10~12塊96孔板，使80%雜交瘤生長為單克隆，減少克隆化次數(shù)，陽性孔不易丟失。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備六.融合細胞觀察與換液：1.

第2~3天骨髓瘤細胞退化、核縮、碎裂，

增生、吞噬碎片；第4~5天可見小堆雜交瘤細胞生長。記錄。2.

融合后5~7天確認骨髓瘤細胞全部死亡，毛細吸管吸出0.1ml~0.15mlHAT，換成同量HT培基。腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體制備七.雜交瘤抗體檢測：

培基變黃，雜交瘤細胞占孔底面積1/4、狀態(tài)好，可測上清液抗體（非分泌性比分泌性雜交瘤長速快），及時測抗體及時克隆化，以免目的雜交瘤丟失。測定時間：融合后10~15天，第２次換液3天后，ELISA、冰凍切