DB4505T 0008-2023 島礁貝類生態(tài)增殖技術(shù)規(guī)范

4505TechnicalspecificationforecologicI前言 III 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14海域選擇 24.1自然條件 24.2海水理化條件 25物種選擇 26種苗培育及苗種要求 27苗種檢驗(yàn)檢疫 27.1檢驗(yàn)資質(zhì)機(jī)構(gòu)要求 27.2抽檢原則與數(shù)量要求 37.3檢驗(yàn)內(nèi)容與方法 38生態(tài)增殖 38.1苗種的適應(yīng)性馴化及優(yōu)選 38.2苗種運(yùn)輸方法 38.3底播增殖 49增殖容量 410貝類豐度監(jiān)測 4 410.2潛水?dāng)嗝嬖O(shè)置 410.3豐度監(jiān)測與計(jì)算 411效果評估 411.1基于貝類豐度的增殖效果評估 4 511.3基于增殖群體回捕占比率的增殖效果評估 5 6附錄A(規(guī)范性)貝類生態(tài)增殖放流情況記錄表 7附錄B(資料性)基于環(huán)境DNA的貝類豐度計(jì)算 8B.1特異性qPCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì) 8 8 8 8附錄C(資料性)基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的貝類增殖群體回捕占比率計(jì)算 C.6貝類回捕抽樣樣本的遺傳區(qū)分及回 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1島礁貝類生態(tài)增殖技術(shù)規(guī)范GB/T12763.6海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋SC/T9401.6水生生物增殖放流技術(shù)規(guī)程第6部SC/T9401.11水生生物增殖放流技術(shù)規(guī)程第11部分：投放農(nóng)業(yè)部公告第1125號一、二、三類動(dòng)物疫病病種目錄（水生動(dòng)生態(tài)增殖ecologicalenhanc適應(yīng)性馴化adaptivedome通過播撒底棲生物苗種到適合的海底生境中，利用天然生產(chǎn)力增加放流種群產(chǎn)量的過從環(huán)境樣本中提取的所有DNA的集合，包括環(huán)境微生物以及從生物體上脫落下來的活細(xì)胞DNA和因24海域選擇類的貝類，篩選確定貝類生態(tài)增殖的海域。增殖海域應(yīng)生態(tài)環(huán)4.2海水理化條件表1增殖海域海水理化因子要求5物種選擇馬氏珠母貝(P.fucata)、珠母貝(P.margaritifera)、企鵝珍珠貝(Pteriapenguin)、雜色鮑(Haliotisdiversicolor)、塔形馬蹄螺(Trochuspyramis)和福建牡蠣(Crassostreaangulata)。6種苗培育及苗種要求6.1參照SC/T216.2用于生態(tài)增殖的貝苗應(yīng)活力強(qiáng)、外觀無損傷、無畸形、規(guī)格整齊。規(guī)格應(yīng)符合表2的要求。表2生態(tài)增殖貝類苗種規(guī)格中規(guī)格7苗種檢驗(yàn)檢疫3規(guī)格合格率≥90%以上，死亡個(gè)體比例、傷殘率生動(dòng)物疫病病種8生態(tài)增殖b)投放貝類小規(guī)格苗種10000個(gè)或中規(guī)格苗種4000個(gè)或大規(guī)格苗種2000個(gè)，每10m2投放與貝類苗種等規(guī)格的蟹5只，在底播生態(tài)增殖前對貝類苗種進(jìn)行為期7d的躲避天敵能力的適應(yīng)性c)第8d不投喂飼料，只進(jìn)行大量換水，并進(jìn)行吸底，以去除貝苗的排泄物。8.2.1水運(yùn)法一般采用水車，在車內(nèi)用空調(diào)將溫度控制在20℃~30℃,車內(nèi)配備充氣裝置及降溫設(shè)備，運(yùn)輸時(shí)間宜控制在48h以內(nèi)，運(yùn)輸時(shí)間大于48h時(shí)，需就地暫養(yǎng)后再進(jìn)行運(yùn)輸。8.2.2干運(yùn)法8.2.2.1充氣干運(yùn)法：適合短途運(yùn)輸。將貝類苗種放入雙層塑料袋內(nèi)，密度控制在小規(guī)格貝苗150個(gè)/L或中規(guī)格貝苗100個(gè)/L或大規(guī)格貝苗50個(gè)/L,注入純氧后，將塑料袋放入泡沫箱內(nèi)，密封。將泡沫箱放入轉(zhuǎn)運(yùn)框中，蓋上頂蓋以防貝類逃逸。運(yùn)輸時(shí)間宜控制在10h以內(nèi)。8.2.2.2非充氣干運(yùn)法：適合部分牡蠣苗種的短途運(yùn)輸。此方法一般用濕毛巾覆蓋在苗種上，保持苗4貝類苗種宜在每年的3～12月進(jìn)行底播。選擇晴朗、多云或陰天進(jìn)行貝類底播生態(tài)增殖，海面最大風(fēng)力≤5級，氣溫≤35℃。采用本文件8.2中的方法將貝類苗種運(yùn)輸至底播預(yù)定海域。船速：2m/s~4m/s,投放密度：0.1個(gè)/m2~0.2個(gè)/m2,苗種底播按照SC/T9401.11中的方法進(jìn)行，記錄投放中心位點(diǎn)的經(jīng)緯度、投放數(shù)量和覆蓋范圍，填寫貝類增殖放流情況記錄表(見附錄A)。不超過增殖海域歷史上礁棲貝類最大捕撈產(chǎn)量的2倍。按GB/T12763.6的規(guī)定進(jìn)行潛水員配備和設(shè)備準(zhǔn)備。10.2潛水?dāng)嗝嬖O(shè)置在生態(tài)增殖海域每平方公里設(shè)置1個(gè)監(jiān)測斷面，斷面應(yīng)均勻分布于增殖海域，每個(gè)斷面寬1.2m,直線距離50m,斷面設(shè)置方法為：在監(jiān)測海域內(nèi)，通過潛水設(shè)定起點(diǎn)，沿礁石走向拉皮尺至終點(diǎn)，起點(diǎn)到終點(diǎn)總距離為50m。10.3豐度監(jiān)測與計(jì)算潛水員沿皮尺方向進(jìn)行斷面內(nèi)貝類調(diào)查，觀察到的貝類個(gè)體均計(jì)入貝類數(shù)量，并根據(jù)貝類形態(tài)辨別貝類種類，進(jìn)行斷面內(nèi)貝類數(shù)量統(tǒng)計(jì)。調(diào)查海域的貝類豐度計(jì)算見公式(1):式中：A調(diào)查海域的貝類豐度，單位為個(gè)/hm2;S第i個(gè)斷面內(nèi)觀察到的貝類數(shù)量，單位為個(gè)。11效果評估11.1基于貝類豐度的增殖效果評估11.1.1生態(tài)增殖實(shí)施一年后，潛水調(diào)查貝類豐度，基于貝類豐度的生態(tài)增殖效果評估值(Ro)計(jì)算見5公式(2):Re=[(Ae?-Ae?)/Aq?]×100%……2)增殖效果評估分級優(yōu)良差B),基于環(huán)境DNA的貝類生態(tài)增殖效果評估值(RE)計(jì)算見公式(3):增殖效果評估分級優(yōu)良差增殖效果評估分級優(yōu)良差67pH8分別針對所有用于生態(tài)增殖的貝類種類的線粒體COI基因或基因組DNA特異區(qū)域設(shè)計(jì)種特異性qPCRST——質(zhì)粒濃度，單位為拷貝/μL；CON——質(zhì)粒檢測濃度，單位為μg/μL；NT——質(zhì)粒堿基數(shù)量，單位為bp。用本文件B.1設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以測得的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)粒濃度的對使用標(biāo)準(zhǔn)采水器收集貝類生態(tài)增殖海域的底層海水，每個(gè)點(diǎn)采集膜對底層海水進(jìn)行過濾，剪碎濾膜，采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒對濾膜上的生物樣本進(jìn)行B.4.2環(huán)境DNA的qPCR擴(kuò)增及增殖種擴(kuò)增體系為20μL，測量樣品Ct值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得Ct值9在調(diào)查海域至少設(shè)置采樣點(diǎn)6個(gè)，采集采樣點(diǎn)海域的底層海水500mL，提取環(huán)境DNA，并按照本文件B.4.2的方法對樣品中生態(tài)增殖種類貝類的DNA進(jìn)行定量，底層海水中生態(tài)增殖種類貝類DNA豐度的計(jì)算）：a——生態(tài)增殖的貝類種類個(gè)數(shù)；AEij——調(diào)查海域第i個(gè)采樣點(diǎn)底層海水中第j種生態(tài)增殖種類貝類DNA豐度，單位為拷貝/mL。樣本采集后，用剪刀剪取一塊200mg～500mg的貝類體壁組織，置于10mL離心管中，加入5mL95%采用常規(guī)的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取貝類樣本DNA，DNA濃度≥50ng/μL，對于每個(gè)用于生態(tài)增殖的貝類種類，分別篩選具有種特異性的高度多態(tài)性SSR標(biāo)記。篩選方法為：采集不同地理分布的各種貝類群體，進(jìn)行基因組測序并利用MISA軟件分別查找具有地理差異的各種貝組中分別篩選出20個(gè)～30個(gè)具有高度多態(tài)性C.6貝類回捕抽樣樣本的遺傳區(qū)分及回捕占利用本文件C.5的分型結(jié)果，通過GenAIEx6.51b2和原生種群間的遺傳距離，如某一種類貝類回捕抽樣樣本與該種類增殖苗種群體具有相似的分子遺傳特征，且