友康 NK高性能版使用說明書2024.3.12

Nkcellserum-freeculturekit5.0NK細胞無血清培養(yǎng)套裝高性能版(接種血量50mL培養(yǎng)體系)I使用說明交件InstructionInstructionmanual使用前請仔細閱讀本操使用前請仔細閱讀本操友康生物科技(北京)股份有限公司NK細胞無血清培養(yǎng)套裝使用說明書——高性能版50mL血【適用范圍】用于外周血或臍血體外誘導擴增NK細胞【產品組成】適用于50mL外周血或臍血的樣本量,使用2~3L培養(yǎng)基高性能版NK細胞無血清培養(yǎng)基NC0102.FNK細胞前期激活使用1瓶,200mL/瓶2~8℃NK細胞無血清培養(yǎng)基NCO102NK細胞體外培養(yǎng)2瓶,1L/瓶2~8℃NK細胞誘導擴增試劑盒(高性能版)AN0104-2YCOOA:起始培養(yǎng)時包被培養(yǎng)瓶使用1支,500YL/支1支,500YL/支1支,200YL/支YC005:擴增培養(yǎng)基添加2支慶大霉素:添加至培養(yǎng)基使用1支,300YL/支注意:每次添加的培養(yǎng)基需提前取出放置培養(yǎng)箱中預溫至37℃,禁止將整瓶培養(yǎng)基放置37℃反復預溫?！締蝹€核細胞分離】1.試劑準備分離單個核細胞前,應將外周血、PBS(生理鹽水)和淋巴細胞分離液室溫平衡至20℃。2.血漿提取(離心機型號ThermosT-40R)(1)將外周血平均分裝到50mL離心管中,于室溫下700g離心15min(離心機升速8,降速4),取上層淡黃色血漿至新的50mL離心管中(下層紅色液體用于提取單個核細胞),于水浴鍋中56℃滅活30min。時離心機的升降速均調至最高即可)3.單個核細胞的分離(1)外周血:取上一步血漿提取后得到的下層紅色液體用生理鹽水1:1稀釋,混勻,備用。臍帶血:取上一步血漿提取后得到的下層紅色液體用生理鹽水1:2稀釋,混勻,備用。(2)另取2支新的50mL的離心管,根據(jù)稀釋血液的體積,按照1:的比例將稀釋血液緩慢加到淋巴細胞分離液上層。(如20mL稀釋血液,需要20mL分離液)使血液和淋巴細胞分離液形成一個明顯的分層,注意不要將稀釋血液混入到淋巴細胞分離液中,室溫700g離心30min。(離心機調節(jié)升速6,降速4)(3)輕輕吸取單個核細胞(白膜層)并轉移至新的50mL離心管內,加入等體積生理鹽水,室溫700g離心10min。棄上清,再次用40mL生理鹽水清洗細胞,200g離心10min,棄上清。用預溫至37℃的培養(yǎng)基重懸細胞,備用,同時取少量細胞懸液計數(shù)。(離心機升速均調節(jié)至9,降速9)注意:臍帶血單個核細胞計數(shù)前應使用紅細胞裂解液裂解紅細胞?！驹噭蕚洹?.激活培養(yǎng)基(200mL):將一支室溫融化的YCOOC(200PL)加入200mL高性能版NK細胞無血清培養(yǎng)基(貨號:NC0102.F)中,混勻備用。2.擴增培養(yǎng)基(2L):每支YC005用1mLNK細胞無血清培養(yǎng)基(貨號:NC0102)溶解,以1:1000的比例添加至NK細胞無血清培養(yǎng)基(貨號:NC0102)中,混勻備用。注意:前5天必須使用激活培養(yǎng)基,不可使用擴增培養(yǎng)基?！臼褂貌襟E】1.第。天T75培養(yǎng)瓶包被:TC處理的T75瓶中加入10mLDPBS和1支YCOOA,充分混勻后,37℃孵育2h,棄去上清,并用10mLDPBS清洗一次,注意不要沖刷培養(yǎng)瓶底部,棄清洗液后備用。PBMC接種:T75瓶中加入激活培養(yǎng)基、1支誘導因子YCOOB、10%比例的自體血漿(3mL)和單個核細胞,總體積30mL,外周血單個核細胞細胞密度2E6/mL,臍帶血單個核細胞密度3E6/mL。注意:因臍血單個核細胞中易摻入紅細胞,計數(shù)結果常出現(xiàn)大的誤差,這會導致接種密度出現(xiàn)偏差,應使用紅細胞裂解液將紅細胞裂解后再計數(shù)。YCOOA包被2h仍無法接種細胞時,將含有YCOOA包被液的T75瓶轉移到2~8℃冰箱保存、不要劇烈晃動,接種前取出清洗即可。2~8℃冰箱中可保存12h。2.第3天1:1比例補液,T75瓶中補加30mL激活培養(yǎng)基和5%的自體血漿(1.5mL),動作輕柔、不可將貼壁細胞晃起。此時總體積60mL。3.第5天補加140mL激活培養(yǎng)基和5%的自體血漿(7mL),將T75瓶中的培養(yǎng)基和細胞平均分至2個T175瓶。此時每個T175瓶中有細胞懸液100mL,總體積200mL。注意:T175瓶培養(yǎng)體積不宜過大,建議使用兩個T175。2<—>若使用友康FEP培養(yǎng)袋,參考以下內容:取樣計數(shù):①外周血樣本,若細胞密度21E6/mL,直接1:2補液,若細胞密度<1E6,延遲一天1:2補液。②臍帶血樣本,若細胞密度21.5E6/mL,直接1:2補液,若細胞密度<1.5E6,延遲一天1:2補液。注意:友康FEP培養(yǎng)袋(2L)培養(yǎng)600mL體積不需對折,使用全部底面積。5.第9天1:1比例補液,補加600mL擴增培養(yǎng)基,總體積1200mL。6.第11天補加1000mL擴增培養(yǎng)基,總體積2200mL。7.第14~16天檢測密度收獲細胞。【補液程序】——使用友康FEP培養(yǎng)袋,終體積2.2L1XT75激活培養(yǎng)基3mLd31XT75激活培養(yǎng)基5%1.5mLd52XT175激活培養(yǎng)基140mL200mL5%7mLd71x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基400mL600mL4mL1x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基600mL1200mL1x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基1000mL2200mLd14~161x培養(yǎng)袋收獲細胞31:1比例補液,補加200mL擴增培養(yǎng)基,此時總體積400mL。添加1%血漿,若血漿不足1%則將剩余血漿全部添加進去。將培養(yǎng)基和細胞全部轉移至1個細胞培養(yǎng)袋中。注意:2L規(guī)格的培養(yǎng)袋培養(yǎng)400mL體積需對折,使用1/2底面積。5.第9天1:1比例補液,從原有的細胞培養(yǎng)袋中取出200mL細胞懸液到第2個細胞培養(yǎng)袋,再向2個細胞培養(yǎng)袋中分別補加200mL擴增培養(yǎng)基。此時每個細胞培養(yǎng)袋中有細胞懸液400mL,總體積800mL。注意:2L規(guī)格的培養(yǎng)袋培養(yǎng)400mL體積需對折,使用1/2底面積。6.第11天1:1比例補液,補加800mL擴增培養(yǎng)基。此時每個細胞培養(yǎng)袋中有細胞懸液800mL,總體積1600mL。7.第13天補加600mL擴增培養(yǎng)基。此時每個細胞培養(yǎng)袋中有細胞懸液1100mL,總體積2200mL。8.第16~18天檢測密度收獲細胞?！狙a液程序1】——第7天密度<1.5E6/mL,終體積2.2L1×T75激活培養(yǎng)基3mLd31XT75激活培養(yǎng)基5%1.5mLd52XT175激活培養(yǎng)基140mL200mL5%7mLd71x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基200mL400mL2mL2x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基400mL800mL2x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基800mL1600mLd132x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基600mL2200mLd16~182x培養(yǎng)袋收獲細胞4【補液程序2】——第7天密度<1.5E6/mL,終體積3.2L1XT75激活培養(yǎng)基3mLd31XT75激活培養(yǎng)基5%1.5mLd52XT175激活培養(yǎng)基140mL200mL5%7mLd71x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基200mL400mL2mL2x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基400mL800mL2x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基800mL1600mLd132x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基1600mL3200mLd16~182x培養(yǎng)袋收獲細胞1:2比例補液,補加400mL擴增培養(yǎng)基,此時總體積600mL。添加1%血漿,若血漿不足1%則將剩余血漿全部添加進去。將培養(yǎng)基和細胞轉移至1個細胞培養(yǎng)袋中。注意:2L規(guī)格的培養(yǎng)袋培養(yǎng)600mL體積不需對折,使用全部底面積。5.第9天1:1比例補液,從原有的細胞培養(yǎng)袋中取出300mL細胞懸液到第2個細胞培養(yǎng)袋,再向2個細胞培養(yǎng)袋中分別補加300mL擴增培養(yǎng)基。此時每個細胞培養(yǎng)袋中有細胞懸液600mL,總體積1200mL。注意:2L規(guī)格的培養(yǎng)袋培養(yǎng)600mL體積不需對折,使用全部底面積。6.第11天1:1比例補液,補加1000mL擴增培養(yǎng)基。此時每個細胞培養(yǎng)袋中有細胞懸液1100mL,總體積2200mL。7.第14~16天檢測密度收獲細胞。5【補液程序3]——第7天密度21.5E6/mL,終體積2.2L1XT75激活培養(yǎng)基3mLd31XT75激活培養(yǎng)基5%1.5mLd52XT175激活培養(yǎng)基140mL200mL5%7mLd71x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基400mL600mL4mL2x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基600mL1200mL2x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基1000mL2200mLd14~162x培養(yǎng)袋收獲細胞【補液程序4】——第7天密度21.5E6/mL,終體積3.2L1XT75激活培養(yǎng)基3mLd31XT75激活培養(yǎng)基5%1.5mLd52XT175激活培養(yǎng)基140mL200mL5%7mLd71x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基400mL600mL2mL2x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基600mL1200mL2x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基1200mL2400mLd132x培養(yǎng)袋擴增培養(yǎng)基800mL3200mLd16~182x培養(yǎng)袋收獲細胞【特別說明】1.分離PBMC分離單個核細胞應特別注意兩點,一是分離單個核細胞前血液及各試劑應預溫至20℃,室溫離心;二是血液采集后應在8h內分離PBMC。2.接種密度外周血單個核細胞推薦接種密度為2E6/mL,新鮮臍帶血單個核細胞推薦接種密度為3E6/mL,凍存臍帶血單個核細胞推薦接種密度為3.5E6/mL,接種密度過低或過高對最終收獲的細胞數(shù)和NK純度都會有影響。3.試劑保存NK試劑盒因子禁止反復凍融,否則會降低其活性,導致陽性率較低。如暫時不用,請置于-20℃保存。已經融化的因子,如一周內使用,4℃保存即可。4.單個核細胞的保存計數(shù)、預溫培養(yǎng)基、等待因子融化等暫時不使用PBMC時,應將PBMC保存于37℃培養(yǎng)箱,避免受涼。5.YCOO