DB51T 2685-2020 豬偽狂犬病毒交叉引物恒溫擴(kuò)增(CPA) 檢測方法

DB51DB51/T2685—2020豬偽狂犬病毒交叉引物恒溫擴(kuò)增（CPA）檢測方法2020-07-14發(fā)布2020-08-01實施四川省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 2 3 4 6 7 81GB/T6682分析實驗室用GB/T25172—2010豬常溫精液SN/T3567.1—2013交叉引BstDNA聚合酶（BstDNApolym24.4普通冰箱：2℃~8℃。4.8高壓滅菌鍋。4.9干烤滅菌器。6.10偽狂犬病毒陽性對照樣品和陰性對照樣品：陽性對照使用滅活疫苗或組織培養(yǎng)37.2.5組織樣品采集：取大腦海馬背側(cè)皮層、中腦、腦橋、三叉神經(jīng)節(jié)、扁桃采集的樣品可立即用于檢測。不能立即檢測的樣品，在2℃-8℃下保存應(yīng)不超過24h，-20℃±5℃下8.1.1核酸提取區(qū)進(jìn)行操作。DNA提取使用DNAzol手工提取，也可以使用商品化試劑盒提取。8.1.4取900μL上清，置于新的1.5ml8.1.6用30μL8mmol/LN在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。設(shè)CPA反應(yīng)管為n,n為待檢樣品數(shù)量加上陰陽性對照方法一：將PCR反應(yīng)管置恒溫設(shè)備(水浴鍋、金屬浴)上，63℃避光溫浴35min。方法一：實驗室若暫時無石蠟油，可將PCR管置于普通PCR儀，程序設(shè)置熱蓋105℃,樣品孔63℃,將恒溫擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管(不可開蓋，以避免污染)放入一次性核酸檢測裝置(含核酸檢測試紙條)(按照SN/T3567.1—2013中附錄B操作),檢查液泡有無漏液以及是否在下圖(圖1)所示位置，蜜放入內(nèi)中圖1操作示意圖試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于質(zhì)控區(qū)(C線),一條位于檢測區(qū)(T線),結(jié)果判定為陽性。試紙條質(zhì)控區(qū)(C線)出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測區(qū)(T線)沒有條帶，結(jié)果判定為陰性。試紙條質(zhì)控區(qū)(C線)和檢測區(qū)(T線)均未出現(xiàn)條帶，或僅檢測區(qū)(T線)出現(xiàn)紅色條帶，檢測結(jié)果無效。表明試紙條已損壞、失效或者操作有誤。此時應(yīng)查找并排除原因，并對此樣本進(jìn)行重復(fù)實驗。(圖2)□□TCTTCT圖2檢測結(jié)果判讀示意圖456 7 PRVgEp15'-ACGAGCCCCGCTTCCA-3’PRVgEp25'-CATGTCCGAGACCACGCGCGTCCACTCGCAGCTCTTCT-PRVgEp3PRVgEp45'-Biotion-CATGTCCGAGACCACGCGCG-3’PRVgEp55'-CCAGCGTGGCGGTAAAGTTCTC-3’PRVgEp6注：引物和探針可由生物公司合成，用TE溶液溶解并稀釋至100μmol/L儲存濃度，-20℃保存?zhèn)溆?，保存期?年；8 PRVgEp1（40μmol/L）PRVgEp2（40μmol/L）PRVgEp3（40μmol/L）PRVgEp4（40μm