DB51T 2466-2018 鲇擬態(tài)弧菌病診斷技術(shù)規(guī)程　

1DB51DB51/T2466—2018鲇擬態(tài)弧菌病診斷技術(shù)規(guī)程2018-04-18發(fā)布2018-05-01實(shí)施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 5 6 81本標(biāo)準(zhǔn)適用于南方鲇（Silurusmeridionalis）、黃顙魚(yú)（Pelteobagrusfulvidraco）與雜交鲇（SilurusGB/T4789.7食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)SC/T7201.1魚(yú)類細(xì)菌病檢疫技術(shù)規(guī)程2按GB/T4789.28、GB/T18652、SC/T7014與GB/T4789.7規(guī)定執(zhí)行，Taq酶、dNTPs、10×PCR緩沖dnaJ基因DNA序列擴(kuò)增引物，P-F：5’-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA-3’，P-R：5’-YC鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、普通冰箱、高速冷凍離心機(jī)、微量移液器、PCR擴(kuò)增儀、離心管和PCR無(wú)菌鹽水沖洗并搗碎，然后分離接種。樣品常規(guī)劃線接種TSA瓊脂培養(yǎng)基（A.128℃培養(yǎng)24h-48h。3將待檢菌接種于酯酶（Tween80）測(cè)定培養(yǎng)基平板（A.228℃培養(yǎng)7d在細(xì)菌生長(zhǎng)的周圍有模糊9.2.9糖、醇類（D-葡萄糖、D-甘露醇震蕩懸浮，加入50μL10％的SDS溶液（A.5加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.7充分混勻，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.8）混勻，65℃溫育20min。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1A.9混勻，12000r/min離心5min。取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1A.10混勻，12000r/min離心5min。取上清液，加入1倍體4混勻后，3000r/min離心30s。設(shè)空白對(duì)照，空白對(duì)照取等體PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min；35次循環(huán)；72℃延膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍(lán)指示劑溶液（A.12）混合后加入樣9.3.4.1.437℃水浴將凍結(jié)的凝膠9.3.4.1.5取上層水相轉(zhuǎn)入另一個(gè)離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25﹕24﹕1A.99.3.4.1.6取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1A.10混勻，12000r/min離心5min。5+++-+++-+ +PCR擴(kuò)增獲得約177bp的dnaJ基因目的片段，其序列與附錄所列的基6 A.2酯酶（Tween80）試驗(yàn)測(cè)冷卻基礎(chǔ)培養(yǎng)基至40℃-50℃,加Tween80至終濃度為1％，倒平板。7將0.121gTris堿（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二鈉（分子量372.24）加入80mL雙蒸水將29.22gNaCl（分子量58.444.1gNaCl溶解于80mL雙蒸水中，緩將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加雙蒸水定容至將溴酚藍(lán)100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過(guò)夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴81ATGGAACTGAGCCTTGAAGAAGCGGTTCGTGGA61TTGGTTCACTGCGATGCTTGTGATGGTTCTGGTGCGAAAAAAG