DB51T 2521-2018 蛙腦膜炎敗血伊麗莎白菌病診斷技術(shù)規(guī)程

1DB51DB51/T2521—2018蛙腦膜炎敗血伊麗莎白菌病診斷技術(shù)規(guī)程2018-07-23發(fā)布2018-08-01實(shí)施四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 5 6 91是指由腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)感染引起的蛙類發(fā)病或死亡的2按GB/T4789.28、GB/T18652與SC/T7014規(guī)定執(zhí)行。Taq酶、dNTPs、10×PCR緩沖液（無Mg2+）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物與核酸提取試劑盒等選用專業(yè)試劑公司提供的商品化試劑，上述未提及的見附錄Infusion,BHIA.1）。28℃培養(yǎng)36h～48h后3將待檢菌穿刺接種在精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基（A.2）上。28℃培養(yǎng)48h。菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)粉紅將待檢菌接種于DNA酶培養(yǎng)基平板（A.4）上，28℃培養(yǎng)48h。菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)粉紅色暈圈為陽按SC/T7014表2的乙酰甲基甲醇（V-P）試驗(yàn)的規(guī)定執(zhí)行。培養(yǎng)基下層出現(xiàn)紅色為陽性，不出現(xiàn)紅9.2.11糖、醇類（葡萄糖、甘露醇）4取2mL待檢菌培養(yǎng)液，12000r/min離心1min，收集菌體；菌體懸浮于500μLTE緩沖液（pH8.06），震蕩懸浮，加入50μL10％的SDS溶液（A.7），10μL20mg/mL的蛋白酶K（A.8），混勻，37℃溫育1h；加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.9），充分混勻，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.10）混勻，65℃溫育20min；加入等體積的酚﹕氯仿﹕異戊醇（25:24:1）（A.11），混勻，12000r/min離心5min；取上清液加入等體積的氯仿﹕異戊醇（24:1A.12混勻，12000r/min離心5min；取PCR擴(kuò)增體系：在PCR管中加入10×PCR緩沖液（無Mg2+）5.0μL，MgCl2（25mmol/L）5.0μL，dNTPs（10mmol/L）1.0μL，引物(20μmol/L)F和R各1.0μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，無PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min；共35個(gè)循環(huán)；最用TAE電泳緩沖液（A.13）配制1％的瓊脂糖平板，凝固后放入水平電泳槽，使電泳緩沖液沒膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍(lán)指示劑溶液（A.14）混合后加入樣品孔，使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對(duì)照。120V電泳約20min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)9.3.4.1.4取上清液加入等體5++-+--+-++-+測定的16SrRNA基因DNA序列與附錄B6試劑配方 70.1g除DNA和甲苯胺藍(lán)之外的成分，加熱熔化后調(diào)pH至7.2.加入DNA和甲苯胺藍(lán)將0.121gTris堿（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二鈉（分子量372.24）加入80mL雙蒸水將29.22gNaCl（分子量58.444.1gNaCl溶解于80mL雙蒸水中，緩將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE8在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加雙蒸水定容至將溴酚藍(lán)100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴91ccggggggcgggggtgctata61ctgatgagttgcgaacgggtgagt121tattggaaacgatagctaata241ctcaccaaggcgaaccgataacatagcccgacc301ctgagacacggcycagactc361aagtctgaycgagcawcgccgcgtgagtgamgaasgttttcgg421ttagagaagaacgttggtaggagtggaaaatctacca481ggacggctaactacgtgccagcag541ttattgggcgtaaagcgagc601aaccattgtacgctttggaaactggaggacttg661tgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggagga721gtctgtaactgacgctgaggctcga781agtccacgccgtaaacgatgagtgctaggt841gctaacgcattaagcactccgcctg901tgacgggggcccgcacaagcgg961ttaccaggtcttgacatccttct1021gtgac