《化妝品 抗羰基化活性的評(píng)價(jià) 秀麗線蟲法》

ICS71.100.70

CCSY40

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GDCA001—2023

化妝品抗羰基化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲法

Cosemtics-Evaluationofanti-carbonylationactivity-caenorhabditiselegansassay

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

廣東省化妝品學(xué)會(huì)發(fā)布

T/GDCA001—2023

化妝品抗羰基化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲法

1范圍

本文件規(guī)定了運(yùn)用秀麗線蟲（以下簡(jiǎn)稱線蟲）評(píng)價(jià)化妝品抗羰基化活性的方法原理及操作。

本文件適用于化妝品（精華、乳液、膏霜等）的抗羰基化活性的功效評(píng)價(jià)，化妝品原料可參考本文

方法。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

T/GDCA013—2022化妝品抗氧化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲法

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

蛋白質(zhì)羰基化ProteinCarbonylation

蛋白質(zhì)羰基化被視為氧化應(yīng)激和衰老的生物標(biāo)志物，是蛋白質(zhì)非酶促不可逆的羰基修飾。蛋白質(zhì)可

與不同來(lái)源的活性羰基類物質(zhì)（reactivecarbonylspecies，RCS）反應(yīng)，生成蛋白質(zhì)羰基加合物，也

能自身氧化生成蛋白質(zhì)羰基衍生物。羰-氨交聯(lián)啟動(dòng)的蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合是老年色素形成的核心生化機(jī)制。

腸脂褐質(zhì)Intestinallipofuscin

腸脂褐素，又被稱為“老年黑色素”，是線蟲衰老的標(biāo)志物，在線蟲腸道中積累并且能夠自發(fā)熒光。

腸脂褐素已被證明可抑制蛋白酶體并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧的形成，在線蟲腸道中合成的羰基化蛋白是線

蟲腸脂褐質(zhì)的主要成分。

4檢測(cè)原理

隨著秀麗線蟲蟲齡增長(zhǎng)，腸道中以羰基化蛋白為主要成分的腸脂褐質(zhì)開始積累。線蟲體內(nèi)羰基化蛋

白的積累與腸脂褐質(zhì)熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)。將同期化的線蟲置于含化妝品或原料的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天，然

后使用熒光顯微鏡以350/50nm（中心波長(zhǎng)/帶寬）波長(zhǎng)激發(fā)腸脂褐質(zhì)，并在460/50nm波長(zhǎng)下檢測(cè)線蟲的

自發(fā)熒光。使用ImageJ軟件量化線蟲的熒光強(qiáng)度值，并以空白組作為對(duì)照，計(jì)算樣品組線蟲的熒光強(qiáng)

度抑制率，從而反映受試樣品的抗羰基化活性。

5材料與試劑

材料

5.1.1秀麗線蟲（以下簡(jiǎn)稱線蟲）：N2野生型秀麗線蟲（Caenorhabditiselegans,theBridtolstrain

N2））購(gòu)自秀麗線蟲遺傳學(xué)中心（CaenorhabditisGeneticsCenter，USA）

5.1.260mm培養(yǎng)皿

5.1.3挑蟲器wormpicker

試劑

除非另有說(shuō)明，化學(xué)試劑使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭Ｅ渲品椒ㄒ姼戒汚。

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T/GDCA001—2023

氯化鈉（NaCl）、硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈣（CaCl2）、氫氧化鈉（NaOH）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、

磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸氫二鈉十二水（Na2HPO4?12H2O）、技術(shù)瓊脂粉、LB肉湯、胰蛋白胨、硫酸鏈

霉素、膽固醇、次氯酸鈉（NaClO）、無(wú)水乙醇、左旋咪唑、瓊脂糖、PBS（1×）

陽(yáng)性對(duì)照品

肌肽粉末CAS#:305-84-0

6實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

連續(xù)變倍體視顯微鏡，物鏡變倍范圍0.7×～4.5×

震蕩培養(yǎng)箱：精度±1℃

生化培養(yǎng)箱：精度±1℃

超凈工作臺(tái)

萬(wàn)分之一天平：精度0.1mg

高壓滅菌鍋

電熱恒溫水浴鍋

熒光顯微鏡

低速離心機(jī)，適配2mL離心管

7實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

繁殖期（3d～5d齡）野生型秀麗線蟲用于同期化。

樣品

樣品包含化妝品原料及產(chǎn)品。配制樣品測(cè)試溶液時(shí)，首選溶劑是M9緩沖液或無(wú)菌水，如需用到有機(jī)

溶劑助溶，可選用二甲基亞砜（DMSO），溶劑于測(cè)試溶液中的濃度要≤2%。針對(duì)不同樣品，需結(jié)合其特

性調(diào)整前處理方法，具體可參照附錄B。

線蟲NGM的配制

7.3.1處理組NGM的配制

按T/GDCA013—2022的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

7.3.2陽(yáng)性對(duì)照組NGM的配制

陽(yáng)性對(duì)照肌肽組：用蒸餾水配置1mg/mL母液，取E.coliOP50菌液和肌肽母液按95：5比例混合均勻，

用移液槍吸取150μL菌液輕緩地打在每個(gè)NGM平板上中央。NGM平板避光晾干后封膜，4℃保存?zhèn)溆?。?/p>

保證樣品活性，樣品板限制在一周內(nèi)使用。

8實(shí)驗(yàn)方法

線蟲同期化

按T/GDCA013—2022的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

預(yù)測(cè)試

按T/GDCA013—2022的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

秀麗線蟲熒光強(qiáng)度測(cè)定

將L4期幼蟲轉(zhuǎn)移至空白組或樣品組NGM上，每隔一天需將線蟲挑至新的NGM板上。培養(yǎng)10天后，用M9

緩沖液清洗線蟲3次。吸取少量6mmol/L左旋咪唑滴在3%瓊脂糖墊載玻片上，每個(gè)處理組挑選至少30條線

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T/GDCA001—2023

蟲轉(zhuǎn)移至左旋咪唑液滴中以麻醉線蟲至無(wú)任何反應(yīng)，拍攝熒光圖像以及明場(chǎng)圖像并對(duì)圖像中每條線蟲

蟲體的熒光強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量分析。

9結(jié)果評(píng)價(jià)

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)組別設(shè)置3個(gè)平行皿培養(yǎng)線蟲。采用ImageJ軟件對(duì)圖像中線蟲腸脂褐質(zhì)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定

量分析（分析方法見附錄C），得到各組熒光強(qiáng)度值和相對(duì)熒光強(qiáng)度值。采用GraphPadPrism軟件繪

制柱狀圖，t-test分析組間差異，p＜0.05表示有顯著性差異。

熒光強(qiáng)度抑制率計(jì)算見公式（1）：

?

抑制率(%)=(1?)×100%···························································(1)

?

式中：

T-樣品組的平均熒光強(qiáng)度值；

C-空白組的平均熒光強(qiáng)度值；

注：相對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度值即T/C×100%

結(jié)果判定及說(shuō)明

熒光強(qiáng)度抑制率大于0，且樣品組熒光強(qiáng)度值與空白組熒光強(qiáng)度有顯著性差異（p＜0.05），說(shuō)明該

樣品在該濃度下，能抑制線蟲腸脂褐質(zhì)的生成，具有抵抗機(jī)體蛋白質(zhì)羰基化的能力，可作為抗羰基化活

性評(píng)價(jià)的證據(jù)支撐。

在同一批次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)比較不同樣品處理下線蟲熒光強(qiáng)度抑制率來(lái)判定其抗羰基化活性強(qiáng)弱。線

蟲熒光強(qiáng)度抑制率越高，則該樣品抗羰基化活性越強(qiáng)。

10實(shí)驗(yàn)有效性的條件

樣本量要求

每個(gè)處理組用于拍攝線蟲熒光圖像的數(shù)量不少于30條。在培養(yǎng)過(guò)程和清洗蟲體過(guò)程中會(huì)損失一部

分線蟲樣本，建議在樣品干預(yù)初期每個(gè)處理組的線蟲不少于90條，以補(bǔ)償一些樣本的損失。

同期化實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

同期化化實(shí)驗(yàn)得到受精卵后26h左右孵化為L(zhǎng)1期的幼蟲。若同期化26h后幼蟲孵化率小于95%，則同

期化實(shí)驗(yàn)失敗。

樣本剔除標(biāo)準(zhǔn)

死亡狀態(tài)下線蟲通體會(huì)產(chǎn)生彌漫性藍(lán)色熒光（俗稱“死亡熒光”），熒光強(qiáng)度激增。實(shí)驗(yàn)中線蟲若

出現(xiàn)激增的死亡熒光，需要剔除該死亡樣本（見附錄D）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

熒光強(qiáng)度抑制率小于0，或空白組與樣品組熒光強(qiáng)度值之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，則該樣

品不具有抗羰基化活性。

批次穩(wěn)定性

每次測(cè)試需要設(shè)置空白組和肌肽陽(yáng)性對(duì)照組。建議初次按本文件進(jìn)行抗羰基化活性評(píng)價(jià)前，先使用

肌肽得到穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，以確保實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒?，再進(jìn)行樣品的抗羰基化活性的測(cè)定?？瞻捉M與陽(yáng)性對(duì)照

組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，則該次實(shí)驗(yàn)視為失敗。

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

培養(yǎng)基、試劑配制方法

A.1培養(yǎng)基、試劑配制

按T/GDCA013—2022的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

A.2線蟲基本操作方法

A.2.1大腸桿菌OP50的培養(yǎng)及涂布

按T/GDCA013—2022的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

A.2.23%瓊脂糖墊載玻片制備

稱取0.6g瓊脂糖加熱溶于20mLPBS緩沖液，趁熱滴加一滴至載玻片上，迅速用另一片載玻片輕輕壓

平，靜置30s后取下上層載玻片即可使用。

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B

B

附錄B

（資料性）

化妝品前處理參考方法

按T/GDCA013—2022的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

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C

C

附錄C

（資料性）

ImageJ測(cè)定線蟲熒光強(qiáng)度的方法

ImageJ軟件測(cè)定線蟲熒光強(qiáng)度的方法如下：

a)在ImageJ軟件中打開明場(chǎng)圖像和熒光圖像（File-Open-SelectFile-Open）；

b)將明場(chǎng)圖像和熒光圖像融合（Image-Stacks-ImagestoStack-OK）；

c)設(shè)置測(cè)量項(xiàng)目（Analyze–SetMeasurements），在彈出界面中選擇需要測(cè)量的項(xiàng)目Area、Mean

grayvalue、Integrateddensity；

d)選擇多邊形工具（菜單欄從左至右第三個(gè)繪圖工具），在明場(chǎng)圖像上完整地勾勒出線蟲的輪廓，

接著移動(dòng)到熒光圖像通道，此時(shí)熒光圖像中線蟲的輪廓被勾勒選中，即可測(cè)量線蟲熒光強(qiáng)度

（Analyze–Measure）；

e)選擇橢圓形工具（菜單欄從左至右第二個(gè)繪圖工具），在一個(gè)只有背景的區(qū)域畫一個(gè)小形狀（不

含線蟲），測(cè)量背景值（Analyze–Measure）；

f)數(shù)值將顯示在“Result”窗口中，選擇所有測(cè)量值并復(fù)制到Excel中保存，計(jì)算面積校正后的

線蟲熒光強(qiáng)度：線蟲Mean-背景Mean。

注：ImageJ軟件下載地址：/Fiji/Downloads

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D

D

附錄D

（資料性）

線蟲圖像

線蟲明場(chǎng)及熒光圖像見圖D.1

圖D.1線蟲明場(chǎng)及熒光圖像

注：箭頭所指為死亡狀態(tài)下的線蟲

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E

E

附錄E

（資料性）

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖表

線蟲腸脂褐質(zhì)的代表性熒光圖見圖E.1,線蟲熒光強(qiáng)度的相對(duì)定量分析圖見圖E.2,肌肽對(duì)線蟲熒光

強(qiáng)度的影響（示例）見圖E.3，線蟲熒光強(qiáng)度值記錄表見表E.1。

圖E.1線蟲腸脂褐質(zhì)的代表性熒光圖圖E.2線蟲熒光強(qiáng)度的相對(duì)定量分析圖

****

200

）

%150

（

度

強(qiáng)100

光

熒50

對(duì)

相

0

空白肌肽

圖E.3肌肽對(duì)線蟲熒光強(qiáng)度的影響（示例）

表E.1線蟲熒光強(qiáng)度值記錄表

相對(duì)熒光強(qiáng)度抑制率

組別

%%

空白/

肌肽

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參考文獻(xiàn)

[1]HosokawaH,IshiiN,IshidaH,etal.Rapidaccumulationoffluorescentmaterial

withaginginanoxygen-sensitivemutantmev-1ofCaenorhabditiselegans[J].Mechanismso

fAgeingandDevelopment,1994,74(3):161-170.

[2]NakamuraA,YasudaK,AdachiH,etal.Vitellogenin-6isamajorcarbonylatedpro

teininagednematode,Caenorhabditiselegans[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCo

mmunications,1999,264(2):580-583.

[3]StadtmanER.Proteinoxidationandaging[J].FreeRadicRes,2006,40(12):1250-

1258.

[4]Yin,D.Biochemicalbasis