《環(huán)保用微生物菌劑菌種鑒定方法》

ICS

備案號：XXXXX

團體標準

T/CECSXXX—XXXX

環(huán)保用微生物菌劑的菌種鑒定方法

MethodsofStrainIdentificationforMicrobialBlendsintheEnvironmental

Protection

（征求意見稿）

202--發(fā)布

202--實施

中國工程建設(shè)標準化協(xié)會發(fā)布

T/CECSXXX-202X

環(huán)保用微生物菌劑的菌種鑒定方法

1范圍

本文件規(guī)定了環(huán)保用微生物菌劑的菌種鑒定方法。

本文件適用于環(huán)保用微生物菌劑的菌種鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

HJ/T415環(huán)保用微生物菌劑環(huán)境安全評價導(dǎo)則

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標準。

3.1環(huán)保用微生物菌劑microbialblendsforenvironmentalprotection

由一種或多種從自然界分離純化，通過自然或人工選育（未經(jīng)基因改造）所獲得微生物

菌種（株）所組成的，應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境保護和污染防治的微生物菌劑。

[來源：HJ/T415-2008,3.1]

3.2細菌bacterium

個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，主要以二分裂方式繁殖的單細胞原核生物。

3.3放線菌actinomycete

具有菌絲、以孢子進行繁殖、革蘭氏染色陽性的原核微生物。

3.4酵母菌yeast

單細胞真核微生物，通常以芽殖或裂殖進行無性繁殖，極少數(shù)種可產(chǎn)生孢子進行有性繁

殖。

3.5霉菌mold

菌體由分支或不分支的菌絲構(gòu)成、不產(chǎn)生肉眼可見子實體的霉菌。

3.6菌種species

由表型特征相似、遺傳性狀相近的菌株組成，并與其他類群的菌株存在明顯差異。

3.7菌株strain

1

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屬于同一個種或亞種，但來源不同的純培養(yǎng)的后代。

3.8培養(yǎng)物culture

一定時間一定空間內(nèi)微生物的細胞群或生長物。

3.9純培養(yǎng)物pureculture

一定時間一定空間內(nèi)由單一微生物細胞繁殖產(chǎn)生的細胞群或生長物。

3.10純度檢測purityexamination

檢測菌種是否為純培養(yǎng)物的過程。

3.11菌落colony

在固態(tài)培養(yǎng)基上由單一微生物細胞生長繁殖形成的肉眼可見的細胞群體。

3.12芽孢spore

某些細菌在生長的一定階段，在細胞內(nèi)形成圓形、橢圓形或圓柱形結(jié)構(gòu)，對不良環(huán)境條

件具有較強抗性的休眠體。

3.13鑒定identification

根據(jù)通用的檢索系統(tǒng)，對未知微生物菌株進行性狀觀察和測定，確定該微生物分類地位

的過程。

4菌種鑒定流程

環(huán)保用微生物菌劑的菌種鑒定流程見圖.1。

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菌種鑒定啟動

純培養(yǎng)物判定

否

是否為純培養(yǎng)物退回

是

培養(yǎng)特征觀察與生理生化特性鑒定遺傳特性鑒定

菌體形態(tài)觀察

鑒定結(jié)果的分析、比較及確認

編制菌種鑒定報告

菌種鑒定結(jié)束

圖1環(huán)保用微生物菌劑的菌種鑒定流程

5鑒定方法

5.1純培養(yǎng)物檢測

5.1.1菌落形態(tài)觀察

在適宜培養(yǎng)基平板上，將待鑒定培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布，經(jīng)適宜條件下培養(yǎng)后，選取劃

線或稀釋涂布分離得到的單菌落，觀察其在同一平板上的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等。

5.1.2菌體形態(tài)觀察

挑取待鑒定細菌培養(yǎng)物，涂布于載玻片上無菌水滴中，進行簡單染色或革蘭氏染色；酵

母菌和霉菌制成水浸片。顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

5.1.3純度確定

菌落和菌體均形態(tài)一致者，可確定為純培養(yǎng)物，可進行后續(xù)菌種鑒定工作；若非純培養(yǎng)

物，則退回。

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5.2培養(yǎng)特征觀察方法

5.2.1細菌

將待鑒定培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（見附錄A)或其他適宜的細菌培養(yǎng)

基平板上，適宜條件下培養(yǎng)2d～5d后，觀察和記錄幼齡和老齡菌落的大小、形狀、質(zhì)地、

邊緣、隆起、顏色、光澤、透明度等性狀。

5.2.2放線菌

將待鑒定培養(yǎng)物點植、劃線或稀釋涂布于適宜的培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)5d～15d，

觀察菌落的大小、形狀、表面狀況、氣生絲、基內(nèi)菌絲的顏色及可溶性色素。

5.2.3酵母菌

將待鑒定培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布于麥芽汁瓊脂（見附錄A)平板上，25℃～28℃培養(yǎng)3d～

7d，觀察菌落的大小、形狀、質(zhì)地、隆起、邊緣、顏色、光澤等性狀。

將待鑒定培養(yǎng)物接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基（見附錄A)中，25℃～28℃培養(yǎng)3d，觀察是

否形成菌膜、菌環(huán)或島及沉淀。

5.2.4霉菌

將待鑒定培養(yǎng)物點種或稀釋涂布于PDA培養(yǎng)基（見附錄A)或察氏培養(yǎng)基（見附錄A)平

板上，25℃～28℃培養(yǎng)2d～14d，觀察菌落質(zhì)地、顏色、生長速度、色素的產(chǎn)生情況、滲出

液、菌落背面的顏色等。

5.3菌體形態(tài)特征觀察方法

5.3.1細菌

挑取在適宜培養(yǎng)基上生長的幼齡培養(yǎng)物，涂片、革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形狀、

大小、革蘭氏染色反應(yīng)等，觀察芽孢的有無、形態(tài)和著生位置。

5.3.2放線菌

將數(shù)個滅菌蓋玻片均勻斜插入培養(yǎng)皿中將要凝固的培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基凝固后沿蓋玻片

與培養(yǎng)基的交接處劃線接種放線菌，正置培養(yǎng)皿于28℃培養(yǎng)數(shù)天，定期取出蓋玻片，用顯

微鏡觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、孢子絲的形態(tài)，孢子著生方式、顏色或孢囊著生位置、孢囊

的形狀。

5.3.3酵母菌

將待鑒定培養(yǎng)物接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基（見附錄A)中，25℃～28℃培養(yǎng)3d，挑取一

環(huán)培養(yǎng)物，壓滴法制成水浸片，觀察細胞大小、形態(tài)和無性繁殖方式。在玉米粉瓊脂（見附

錄A)平板上劃線接種待鑒定培養(yǎng)物，蓋上蓋玻片，25℃～28℃培養(yǎng)3d～5d，低倍顯微鏡下

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觀察劃線處是否形成假菌絲。在適宜生孢子培養(yǎng)基上觀察孢子的形態(tài)特征。

5.3.4霉菌

將待鑒定培養(yǎng)物接種于PDA培養(yǎng)基（見附錄A)或察氏培養(yǎng)基（見附錄A)平板或斜面上，

25℃～28℃培養(yǎng)2d～14d，挑取少量培養(yǎng)物壓滴法制成水浸片，或采用玻片培養(yǎng)法（見附錄

B)，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征、無性繁殖體和有性繁殖體的形態(tài)特征（見附錄B)。

5.4生理生化特性鑒定

參考附錄C所列的待鑒定培養(yǎng)物類群及其他資料，測定對應(yīng)的生理生化項目?？衫梦?/p>

生物自動鑒定系統(tǒng)進行鑒定，方法參照所利用的微生物自動鑒定系統(tǒng)技術(shù)資料。

5.5遺傳特性鑒定

細菌和放線菌可進行16SrDNA序列、gyrB基因序列測序分析，酵母菌、霉菌可進行26S

rDNA中D1/D2區(qū)域序列、18SrDNA序列或ITS序列測序分析。序列測定的常用擴增引物見附

錄D。

6鑒定結(jié)果

根據(jù)實驗結(jié)果，對照通用的鑒定系統(tǒng)，確定待鑒定菌株的分類地位。菌種名稱采用國際

命名規(guī)則，使用屬名和種加詞的拉丁詞，并附加中文譯名。有異名的應(yīng)同時標注。

7鑒定報告

菌種鑒定結(jié)果報告應(yīng)列出送檢單位、送檢時間、樣品編號、名稱、數(shù)量、鑒定操作人姓

名（簽字）、鑒定技術(shù)負責人姓名（簽字）、鑒定內(nèi)容、結(jié)果等信息。采用微生物自動鑒定

系統(tǒng)和（或）序列測定的，應(yīng)附上原始數(shù)據(jù)。

鑒定報告編制大綱可參考附錄E。

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附錄A

（資料性）

常用培養(yǎng)基成分

A.1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

蛋白胨10.0g

牛肉膏；3.0g

氯化鈉（NaCl)5.0g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000ml

pH7.0~7.2

A.2乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）

蛋白胨10.0g

牛肉膏10.0g

酵母膏5.0g

檸檬酸氫二銨[(NH4)2C6H6O7]2.0g

葡萄糖（C5H1206?H2O)20.0g

吐溫801.0g

乙酸鈉（CH3COONa?3H2O)5.0g

磷酸氫二鉀（K2HPO4?3H2O)2.0g

硫酸鎂（MgSO4?7H2O)0.58g

硫酸錳（MnSO4?H2O)0.25g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

pH6.2~6.5

A.3高氏合成一號瓊脂

6

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硝酸鉀（KNO3)1.0g

磷酸氫二鉀（K2HPO4?3H2O）0.5g

硫酸鎂（MgSO4?7H2O）0.5g

氯化鈉（NaCl）0.5g

硫酸亞鐵（FeSO4?7H2O)0.01g

可溶性淀粉［(C6H10O5)n]20.0g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

pH7.2~7.4

A.4葡萄糖-天門冬素瓊脂

葡萄糖（C6H1206?H2O)10.0g

天門冬素0.5g

磷酸氫二鉀（K2HPO4?3H2O)0.5g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

pH7.2～7.4

A.5無機鹽淀粉瓊脂

可溶性淀粉［(C6H10O5)n]10.0g

磷酸氫二鉀(K2HPO4?3H2O)1.0g

硫酸鎂（MgSO4?7H2O)1.0g

氯化鈉(NaCl)1.0g

硫酸銨［(NH4)2SO4］2.0g

碳酸鈣(CaCO3)2.0g

微量元素鹽溶液1.0mL

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

pH7.0～7.4

微量元素鹽溶液：

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硫酸亞鐵（FeSO4?7H2O)0.1g

氯化錳（MnCl2?4H2O)0.1g

硫酸鋅（ZnSO4?7H2O)0.1g

蒸餾水100mL

A.6燕麥粉瓊脂

燕麥片20.0g

微量元素鹽溶液1.0mL

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

pH72～7.4

微量元素鹽溶液：同A.5。

在1000mL蒸餾水中煮沸20.0g燕麥片，通過紗布過濾，加微量元素鹽溶液，補加蒸館

水至1000mL。

A.7葡萄糖酵母膏麥芽膏瓊脂（GYM瓊脂）

葡萄糖（C6H12O6?H2O)4.0g

酵母膏4.0g

麥芽提取物10.0g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

pH7.2～7.4

A.8察氏（Czapeks）培養(yǎng)基

蔗糖（C12H22O11)30.0g

磷酸氫二鉀（K2HPO4?3H2O)1.0g

硫酸鎂(MgSO4?7H2O)0.5g

硝酸鈉（NaNO3)3.0g

氯化鉀(KCl)0.5g

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硫酸亞鐵(FeSO4?7H2O)0.01g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

pH6.0～6.5

A.9麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基

麥芽提取物20.0g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

pH54～6.0

A.10玉米粉瓊脂

玉米粉12.5g

瓊脂5.4g

蒸餾水300mL

pH6.0～6.5

稱取玉米粉，加300mL蒸餾水攪勻，60℃熱水浴保溫1h，用濾紙過濾，濾液加水至300mL。

A.11馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA培養(yǎng)基）

馬鈴薯200g

葡萄糖（C6H12O6?H2O)20.0g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

pH6.0～6.5

稱取去皮馬鈴薯200g切塊，放入水中煮沸30min，用雙層紗布過濾取汁，補足水至1000mL。

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附錄B

（資料性）

常見霉菌的形態(tài)特征觀察

B.1玻片培養(yǎng)法

將滅菌的載玻片放入培養(yǎng)皿中，接種霉菌孢子，用無菌滴管吸取少量冷卻到45℃左右

的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，滴加到載玻片的孢子上，蓋上滅菌的蓋玻片，輕壓使培養(yǎng)基成一薄層，

適溫下培養(yǎng)。如培養(yǎng)的時間較長，需注意保濕，防止瓊脂培養(yǎng)基過早干燥。經(jīng)過一定的時間

培養(yǎng)，取出載玻片，顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征。

B.2常見霉菌的形態(tài)特征觀察

常見霉菌的菌體形態(tài)特征觀察見表B.1。

表B.1常見霉菌的菌體形態(tài)特征觀察

類群菌體形態(tài)特征觀察主要內(nèi)容

根霉、毛菌絲分隔、分枝情況、假根的有無、著生方式；孢囊梗長短、簇生或單生、

霉分枝的類型；孢囊形狀、大小、內(nèi)含孢囊孢子的數(shù)量；囊軸形狀、大小、顏

色；囊托的有無、形狀、大?。绘吣益咦有螤?、大??；厚垣孢子的有無；接

合孢子是同宗還是異宗配合、結(jié)合孢子柄形狀、大小。

曲霉菌絲分隔、分枝情況；分生孢子梗著生方式；分生孢子頭和頂囊的形狀、大

小、顏色；瓶梗的層次、顏色；?；挠袩o；分生孢子的形狀、大小、表面

情況。

青霉菌絲分隔、分枝情況；分生孢子梗著生方式、分校情況；帚狀枝的形狀；瓶

梗、?；透敝?shù)目、大??；分生孢子的形狀、大小。

木霉菌絲分隔、分枝情況；分生孢子梗的分枝狀態(tài)；小梗的形狀、大??；分生孢

子的形狀、大小、色澤；厚垣孢子的有無。

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附錄C

（資料性）

環(huán)保用微生物菌劑中常見菌種類群的生理生化特征測定

環(huán)保用微生物菌劑中常見菌種類群的生理生化特征測定見表C.1。

表C.1常見菌種類群的生理生化特征測定

類群生理生化特征測定

芽孢桿菌氧化酶；接觸酶；卵磷脂酶；厭氧生長；糖、醇類發(fā)酵；V-P測定；淀粉水解；

酪素水解；丙酸鹽利用，硝酸鹽還原；脲酶水解；吲哚產(chǎn)生；苯丙氨酸脫氨

酶；對溫度、pH的需求及耐受性；對鹽的耐受性等。

乳酸桿菌氧化酶；接觸酶，葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸；精氨酸產(chǎn)氨；淀

粉水解；七葉靈水解；牛奶的凝固和胨化；硫化氫產(chǎn)生；明膠液化等。

根瘤菌氧化酶，接觸酶，碳源利用；BTB反應(yīng)；石蕊牛奶反應(yīng)；營養(yǎng)肉汁生長；苯丙

氨酸脫氨酶等。

放線菌碳源利用；明膠液化；淀粉水解；牛奶的凝固和胨化；纖維素分解；硝酸鹽

還原；硫化氫產(chǎn)生；酪氨酸酶產(chǎn)生，類黑色素產(chǎn)生等。

酵母菌碳源利用；糖類發(fā)酵；氮源的同化，在無維生素培養(yǎng)基中的生長情況測定；

溫度生長試驗；尿素分解；脂肪酶分解；明膠液化，石蕊牛奶反應(yīng)；對鹽的

耐受性；抗放線菌酮測試等。

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