《金屬納米材料 水環(huán)境中原生動物四膜蟲生物富集試驗標準》

ICS號

中國標準文獻分類號

中國城市科學研究會標準

T/CSUSXX-202X

金屬納米材料水環(huán)境中原生動物四膜蟲

生物富集試驗

Metallicnanomaterials—Bioconcentrationexperimentusing

theprotozoanTetrahymenaintheaquaticenvironment

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

中國城市科學研究會發(fā)布

1范圍

本標準規(guī)定了對水環(huán)境中四膜蟲進行生物富集試驗的方法，包括術語和定義、

受試材料信息、試驗方法、數據處理、質量控制、數據與報告。

本標準適用于水環(huán)境中金屬納米材料生物富集試驗的指導。

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2術語和定義

下列術語和定義適用于本標準。

2.0.1生物富集bioconcentration

受試生物從水體中蓄積某種物質的現象。

同義詞：生物濃縮

2.0.2生物富集系數bioconcentrationfactor,BCF

受試生物體內受試材料含量與周圍水體中該受試材料濃度的比值，也稱生物

濃縮因子。

2.0.3吸收uptake

受試生物將受試材料從水體中轉移至體內的過程。

2.0.4吸收速率uptakerate

暴露于含有受試材料的水體中，受試生物體內受試材料含量隨時間增加的速

率。

2.0.5吸收速率常數uptakerateconstant,ku

暴露于含有受試材料的水體中，受試材料的吸收速率與其在水體中濃度的比

值。

2.0.6排出elimination/efflux

受試生物體內所蓄積的受試材料轉移出生物體的過程。

2.0.7排出速率常數eliminationrateconstant,ke

假設受試材料的排出過程遵循一級動力學，生物體內受試材料含量在單位時

間內降低的比例。

2.0.8無可觀察效應濃度noobservedeffectconcentration,NOEC

在給定測試周期內，與對照組相比，在統計學意義上對受試生物未產生顯著

效應（p≥0.05）的最高受試物濃度。

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3受試材料信息

在開展生物富集試驗之前，應提供受試材料（金屬納米材料）的以下信息：

a）形貌：主要指金屬納米材料的形狀和表面特征。目前常用的儀器有掃描

電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）等。

b）粒徑：主要指金屬納米材料的初始顆粒尺寸和分散在介質中的尺寸，金

屬納米材料的粒徑會影響其在生物體內的富集。目前常用的測定儀器有動態(tài)光散

射粒度分析儀（DLS）、SEM、TEM和AFM等。

c）化學成分：主要指金屬納米材料的元素組成，是決定金屬納米材料性質

的基本因素。常用的分析儀器有X射線光電子能譜儀（XPS）、電感耦合等離子

體質譜儀（ICP-MS）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）、原子吸收光譜

儀（AAS）等。

d）結構特征：主要指金屬納米材料的晶型結構，可以通過X射線衍射儀

（XRD）、高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）等測定。

e）表面性質：主要包括金屬納米材料的表面官能團、表面電荷、比表面積

等。可借助傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）、Zeta電位分析儀、比表面積分析儀

等儀器分別得到金屬納米材料的表面官能團種類、表面電荷和比表面積等表面性

質的相關信息。

f）穩(wěn)定性：主要包括金屬納米材料的分散性和金屬離子的溶出。金屬納米材

料的分散性可借助DLS、Zeta電位儀、TEM等儀器測定其粒徑和表面電位進行

判斷。金屬納米材料溶出的金屬離子可通過超濾、透析等手段與金屬納米材料分

離，借助ICP-MS、ICP-OES、AAS等儀器進行定量分析。

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4試驗方法

4.1方法原理

本標準選用四膜蟲（Tetrahymena）為受試生物（常見種類參見本標準附錄A），

推薦使用嗜熱四膜蟲（Tetrahymenathermophila）、梨形四膜蟲（Tetrahymena

pyriformis）等。四膜蟲作為一類在水環(huán)境中廣泛分布的原生動物，易于實驗室培

養(yǎng)，是常見的模式生物。四膜蟲可將其積累的顆粒消化，同時將未消化的部分排

出體外。

四膜蟲生物富集試驗主要分為吸收（暴露）階段和排出（暴露后）階段。在

吸收階段，將指數生長后期的四膜蟲暴露在含受試材料的培養(yǎng)基中，受試時間由

預試驗確定。待四膜蟲對金屬納米材料的富集達到一定量，將其與暴露介質分離

并重懸浮于不含受試材料的培養(yǎng)基中，進入排出階段。兩個階段都需要在不同時

間點進行取樣分析，根據四膜蟲與培養(yǎng)基中受試材料含量或濃度計算吸收速率常

數（ku）、排出速率常數（ke）、生物富集系數（BCF）等參數。

4.2主要設備

主要設備如下：

——恒溫培養(yǎng)箱；

——pH計；

——分析天平；

——納米材料性質表征相關儀器（如，DLS、TEM）；

——常用玻璃器皿（如，錐形瓶）；

——細胞計數相關儀器（如，細胞計數儀）；

——離心機；

——樣品消解相關儀器（如，烘箱、石墨消解儀）；

——受試材料濃度測定相關儀器（如，ICP-MS）。

4.3試驗準備

4.3.1受試生物的準備

a）SPP培養(yǎng)基配制：SPP培養(yǎng)基可按本標準附錄B.1的有關規(guī)定進行配制

并滅菌。

b）四膜蟲的保種與復蘇：具體步驟應符合本標準附錄C的有關規(guī)定。

4

c）四膜蟲培養(yǎng)：將處于指數生長期的四膜蟲（推薦細胞密度約為5×105個

/mL）按1:1000（v/v）接種至無菌SPP培養(yǎng)基中，用封口膜密封，于30℃±1℃

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至指數生長后期。

4.3.2受試材料的準備

試驗培養(yǎng)基：為避免SPP培養(yǎng)基中復雜成分對材料穩(wěn)定性造成影響，整個生

物富集試驗在Dryl’s培養(yǎng)基（配方參見本標準附錄B.2）中進行。預先配置Dryl’s

培養(yǎng)基并調節(jié)pH至6.9。

受試培養(yǎng)基配制：試驗前應對受試材料進行物理化學性質表征，受試材料可

用超純水配制成高濃度儲備液并在適宜環(huán)境條件（如，2℃–8℃低溫冷藏）下保

存?zhèn)溆?。試驗前用Dryl’s培養(yǎng)基稀釋儲備液，獲得所需的受試培養(yǎng)基，受試培養(yǎng)

基應提前配制并過夜平衡。

注：受試材料儲備液及受試培養(yǎng)基應為通過攪拌或/和超聲配制而成的分散

懸浮液，盡量不用或慎用助溶劑、分散劑。

4.3.3預試驗及試驗條件設置

正式試驗之前應進行預試驗，以確定受試材料暴露濃度、吸收和排出階段的

試驗時間。

預試驗應設置不少于4個暴露處理組以及空白對照組，受試材料暴露濃度范

圍跨度應足夠大，建議各處理組間使用10倍濃度差。其它試驗條件應與四膜蟲

培養(yǎng)過程保持一致。優(yōu)化離心收集四膜蟲細胞條件：在有效收集細胞的同時應避

免受試培養(yǎng)基中受試材料被收集。若無法有效分離細胞和受試培養(yǎng)基中受試材料，

可通過添加適量的助溶劑或分散劑增加受試材料的分散性以提高兩者的分離效

果。

a）試驗濃度確定：預試驗應在0h、3h、6h、12h和24h對四膜蟲進行計

數并利用光學顯微鏡觀察其細胞形貌與游動速度，通過四膜蟲密度變化計算處理

組與對照組四膜蟲比生長速率（應按本標準附錄D的方法計算）并結合四膜蟲

細胞長寬比和游動速度，確定受試材料的無可觀察效應濃度（NOEC）。后續(xù)正式

吸收試驗受試材料的暴露濃度應低于受試材料對四膜蟲的無可觀察效應濃度。

b）試驗時間：預試驗也應間隔一定時間取樣測定四膜蟲對受試材料的富集

量，初步確定吸收趨于穩(wěn)定（生物富集變化幅度在±20%）的時間。在吸收到達一

定量后可開始排出試驗，排出試驗也應間隔一定時間進行取樣。排出階段時間應

至少設置為四膜蟲體內受試材料含量出現顯著下降，如果排出速度過快或過慢可

根據情況改變排出階段時間。

4.4試驗步驟

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4.4.1正式試驗

整個試驗過程分為吸收和排出兩個階段，包括了三部分內容，具體如下：

a）吸收階段：首先離心（1700g，10min）收集指數生長后期四膜蟲并用Dryl’s

培養(yǎng)基清洗兩次，隨后將四膜蟲懸浮于受試培養(yǎng)基中。受試培養(yǎng)基中四膜蟲初始

密度為0.8–1×105個/mL，暴露時長應根據預試驗結果確定。

b）排出階段：吸收試驗結束后，離心收集四膜蟲并用含有1mmol/LEDTA

的Dryl’s培養(yǎng)基清洗兩次以去除四膜蟲表面弱吸附的受試材料，隨后將四膜蟲重

新懸浮于不含受試材料的Dryl’s培養(yǎng)基中，開始排出試驗。排出階段時間根據預

試驗結果確定。

c）受試材料在生物體內的分布：在吸收階段終點，收集四膜蟲樣品，根據

暴露的受試材料種類選擇合適的制樣方式對受試材料在四膜蟲體內的分布進行

觀察（如，使用TEM觀察受試材料在細胞內的分布）。

4.4.2取樣及樣品制備

取樣分為吸收和排出兩個階段的樣品收集。吸收和排出階段均需采集四膜蟲

樣品至少5次，采樣時間點應均勻設置并包括起始和終止時間點。生物樣本取樣

方法為離心收集受試生物沉淀。同時，在初始和結束時刻采集含有四膜蟲的受試

培養(yǎng)基以及生物樣本離心后上清用以計算和評估試驗過程中受試材料的質量平

衡，并監(jiān)測所取樣品中四膜蟲細胞密度，計算生物富集相關參數。

樣品應根據受試材料選擇適宜的方法（如，硝酸/過氧化氫、王水、氫氟酸法

等）進行消解。

4.4.3樣品測定

樣品經消解后，應根據待測受試材料的類別和濃度選擇合適的測定方法。常

見方法（如，ICP-MS、ICP-OES、AAS等）的測定范圍可參考本標準附錄E的

取值。

為了避免吸附等過程可能造成的損失，生物樣品和水樣采集后應盡快測定，

并計算吸收和排出速率常數等相關參數。若樣品不能及時測定應采取合適的方法

進行保存。試驗開始前應掌握保存特定樣品的方法、明確貯存時間和提取方法等。

以ICP-MS對樣品中金屬含量測定為例進行說明：

a）校準曲線的繪制：儀器開啟運行后，先使用調諧溶液調節(jié)儀器靈敏度、

信噪比等參數以滿足檢測要求，設定分析所需要的功率、氣體流速、質譜測量方

式、積分時間等參數；根據待測金屬類別選擇相應的標準溶液，設置不同濃度梯

度，并加入相應的內標元素。使用內標法對標準溶液進行測定，根據標準溶液理

論濃度和實測信號值繪制校準曲線。

b）樣品測定：樣品消解后，根據需要用超純水或稀酸進行稀釋，記錄稀釋

倍數D。樣品的最終酸度應與標準溶液一致并且不高于2%（v/v）。隨后根據待

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測金屬類別加入對應內標元素，使用ICP-MS測定樣品中相應金屬濃度，每隔10

個樣品插入一個質量控制標準樣品以確保測定數據的穩(wěn)定性和可靠性。標準樣品

的回收率應處于90%–110%之間，通過校準曲線計算待測元素質量濃度。

c）四膜蟲對受試材料富集量的計算：若t時刻四膜蟲富集受試材料的絕對

量為mt，四膜蟲數量為nt，則t時刻四膜蟲對受試材料的富集量Ct按下式計算：

mt

Ct=······························（1）

nt

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5數據處理

5.0.1生物富集系數（BCF）

?

BCF=?······························（2）

?w

式中：Ct——某一時刻（t）四膜蟲中受試材料的含量；

Cw——受試培養(yǎng)基中的受試材料濃度。

5.0.2吸收、排出速率常數（ku，ke）

大多數生物富集過程可用簡單的二參數模型來描述。

在吸收階段，四膜蟲對金屬納米材料的富集可用以下公式表示：

?×?

wu?(?e+?)×?

??=×(1?e)+?ad·········（3）

?e+?

在排出階段，四膜蟲體內金屬納米材料含量可用如下公式表示：

??e×?

??=?0×?··················（4）

式中：ku——金屬納米材料的吸收速率常數；

ke——金屬納米材料的排出速率常數；

μ——四膜蟲的比生長速率；

Cad——金屬納米材料在四膜蟲細胞表面的吸附量，為吸收曲線在縱坐標

（生物富集量）上的截距；

C0——排出階段0時刻四膜蟲中受試材料的含量。

一般情況下如果通過一個方程同時估算ku和ke兩個參數，它們之間會存在

顯著相關性，因此建議首先從排出曲線（公式（4））計算出ke值，然后再用非線

性回歸方法從吸收曲線（公式（3））計算ku值。

需要指出的是，如果吸收和排出曲線明顯不符合公式（3）和（4），則應使

用更加合適的方法或模型進行計算。

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6質量控制

6.1受試材料試驗濃度的設置

——受試材料濃度應低于受試材料對四膜蟲的無可觀察效應濃度；

——受試材料濃度宜盡量參考受試材料的真實環(huán)境濃度。

6.2試驗過程中的質量控制

6.2.1試驗中的質量控制

a）試驗所用的四膜蟲在SPP培養(yǎng)基中生長情況應符合典型的微生物生長曲

線。

b）試驗溫度應保持在30℃±1℃。

c）試驗期間，四膜蟲在試驗培養(yǎng)基中生長正常，不應出現細胞密度顯著下

降、四膜蟲細胞明顯破裂等不良現象。

d）試驗中，四膜蟲對受試材料的富集量加Dryl’s中的剩余量（即未被吸收

的部分）與受試材料的添加總量的百分比值應在90%–110%。

6.2.2檢測過程中的質量控制

a）樣品分析前應設置至少6個標準溶液濃度點（包括空白）來建立校準曲

線。校準曲線濃度范圍跨度應控制在3個數量級以內，且擬合回歸方程中決定系

數R2的值應不小于0.995。校準曲線應保證可重復性，每次檢測都應重新測定、

繪制校準曲線。

b）試驗時每批待測樣品應附帶空白樣品、重復樣品、加標回收樣品?？瞻?/p>

樣品檢測值應與樣品檢出限相當。樣品濃度應處于校準曲線范圍內，推薦處于校

準曲線中部，樣品濃度過低或過高時應濃縮或稀釋后再進行測定。

c）受試樣品定量分析時，應采用加標回收率的方法保證測試結果的準確性，

采用該方法時應保證受試材料加標回收率在80%–120%，加標量應為樣品含量的

0.5倍–2.0倍，加標物形態(tài)應與受試材料相近，加標后總濃度不得超出檢測方法

的檢測范圍。

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7試驗報告

7.1受試材料和受試生物記錄

試驗報告必須包括以下記錄資料。

7.1.1受試材料

形貌、粒徑、化學成分、結構特征、表面性質、穩(wěn)定性等。

7.1.2受試生物

學名、品系、來源、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件（受試培養(yǎng)基等）、生長階段、生

物量等。

7.2試驗條件記錄

以下試驗條件應在本標準附錄F表中進行詳細記錄。

（1）所進行的試驗流程；

（2）四膜蟲的培養(yǎng)條件：如，培養(yǎng)基、pH、溫度、培養(yǎng)容器、接種密度和

接種體積等；

（3）試驗設計：如，試驗設計使用的容器規(guī)格大小、設計的平行數、每個

平行四膜蟲接種密度、四膜蟲吸收及排出受試材料的時間、四膜蟲及受試培養(yǎng)基

取樣頻率及時間等；

（4）受試培養(yǎng)基儲備液的配制方法及使用時的濃度等；

——儲備液濃度、稀釋溶液來源、試驗暴露濃度及受試培養(yǎng)基特性（如，pH、

穩(wěn)定性）等；

（5）四膜蟲培養(yǎng)及暴露時的詳細信息：如，細胞密度，光學顯微鏡下觀察

到的細胞狀態(tài)等；

（6）設定的試驗暴露濃度、受試材料濃度的測定方法和數值（平均值、標

準偏差），受試材料的吸收/排出速率常數、生物富集系數和數值（平均值、標準

偏差）及其計算方法等；

（7）受試材料及受試生物的處理信息，包括詳細的準備、儲存條件等。

7.3試驗現象記錄

（1）試驗期間金屬納米顆粒在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性；

（2）四膜蟲在試驗期間的生長情況、異?，F象。

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7.4結果與評價

7.4.1試驗結果，應包含以下內容：

a）預試驗得到的結果；

b）試驗期間對照組和各暴露組四膜蟲的細胞密度、觀察到的四膜蟲異常行

為（如，游動速度變緩、細胞變圓、細胞破裂等）；

c）記錄試驗時間、取樣時間，所有取樣時間的Ct（四膜蟲中受試材料的含

量）和Cw（試驗液中的受試材料濃度）值；

d）動力學參數（ku，ke等）和生物富集系數（BCF），如有可能，95%置信限

的吸收和排出速率常數，置信限和標準偏差，以及各受試材料濃度的計算和數據

分析方法；

e）試驗中的任何異常情況、試驗程序的調整及其他相關信息。

7.4.2試驗結果的評價，應符合以下規(guī)定：

a）試驗結果質量控制要求的符合情況；

b）根據生物富集系數（BCF）值的大小，應按本標準附錄G的規(guī)定對金屬

納米材料的生物富集等級進行劃分。

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附錄A

（資料性附錄）

推薦用于生物富集試驗的四膜蟲

推薦用于金屬納米材料生物富集試驗的四膜蟲見表A.1

表A.1推薦用于生物富集試驗的四膜蟲種類

物種學名

嗜熱四膜蟲Tetrahymenathermophila

梨形四膜蟲Tetrahymenapyriformis

上海四膜蟲Tetrahymenashanghaiensis

多色四膜蟲Tetrahymenapigmentosa

熱帶四膜蟲Tetrahymenatropicalis

柯式四膜蟲Tetrahymenacorlissi

運動四膜蟲Tetrahymenamobilis

北方四膜蟲Tetrahymenaborealis

明布雷斯四膜蟲Tetrahymenamimbres

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附錄B

（資料性附錄）

推薦用于四膜蟲培養(yǎng)及試驗的培養(yǎng)基

推薦用于培養(yǎng)四膜蟲的SPP培養(yǎng)基見表B.1

表B.1SPP培養(yǎng)基配方

試劑濃度

蛋白胨2%w/w

酵母提取物0.1%w/w

FeCl30.33μmol/L

青霉素G100units/mL

硫酸鏈霉素100mg/L

兩性霉素B0.025mg/L

推薦用于四膜蟲富集金屬納米材料試驗的Dryl’s培養(yǎng)基見表B.2

表B.2Dryl’s培養(yǎng)基配方

試劑濃度（mmol/L）

NaH2PO42.0

Na2HPO41.0

CaCl21.5

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附錄C

(規(guī)范性附錄)

推薦用于四膜蟲保種與復蘇的方法

C.1大豆保種（短期保存，半年左右）與復蘇

a）保種：在無菌環(huán)境下將1mL狀態(tài)良好的四膜蟲接入制備好的大豆培養(yǎng)基

（將一顆黃豆放到裝有10mL超純水的試管中，于103kPa、120℃下滅菌20min

后，冷卻至室溫）中，再加入0.8mL無菌的礦物油，于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

b）復蘇：在無菌環(huán)境下從保種四膜蟲的大豆培養(yǎng)基中取1mL，將其轉入到

盛有30mL的SPP培養(yǎng)基的錐形瓶內，置于搖床（30℃，135rpm）過夜培養(yǎng)，

用光學顯微鏡觀察四膜蟲活性。

C.2液氮保種（長期保存）與復蘇

a）保種：取在SPP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至密度為3×105個/mL的四膜蟲，離心

（1000g，3min）去上清，用10mMTris-HCl（pH7.4）清洗2次并用SPP培養(yǎng)

基重懸浮，于30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2–3天，再次離心將四膜蟲濃縮至1mL，加

入二甲基亞砜凍存劑（終濃度為8%（v/v）），分裝至凍存管內，室溫靜置30min

后放入?80℃冰箱18h–24h，再移至液氮中長期保存。

b）復蘇：取出在液氮中保存的四膜蟲細胞，于42℃下熱激20s后緩慢加入

1mL42℃孵育的SPP培養(yǎng)基，融化后將其加入30mLSPP培養(yǎng)基中，于30℃條

件下培養(yǎng)，24h后用光學顯微鏡觀察四膜蟲活性。

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附錄D

（資料性附錄）

四膜蟲比生長速率的計算

D.1四膜蟲比生長速率的計算

比生長速率（μ）即測試期間，細胞密度自然對數值在單位時間內的變化率。

ln??ln?

?=?0

?

式中：μ——四膜蟲的比生長速率；

Dt——t時刻的四膜蟲細胞密度；

D0——0時刻的四膜蟲細胞密度。

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附錄E

（資料性附錄）

推薦用于常見金屬納米材料所含金屬的測定方法及其適用范圍

推薦用于常見金屬納米材料所含金屬的測定方法及其適用范圍見表E.1

表E.1常見金屬納米材料所含金屬的測定方法及其適用范圍

檢出限測定范圍

分析方法元素

（μg/L）（μg/L）

Ag0.010.05–100

Al210–500

Au0.060.15–100

Cd0.050.2–100

電感耦合等離子體Ce0.010.05–100

質譜法Cu0.150.5–100

（ICP-MS）Fe1.55–1000

Mg0.31–1000

Mn0.050.2–100

Ti0.501.5–100

Zn0.100.5–100

Ag1030–5000

Al30100–5000

Au0.150.5–1000

Cd1030–2000

電感耦合等離子體Ce1030–2000

發(fā)射光譜法Cu30100–1000

（ICP-OES）Fe30100–50000

Mg1030–100000

Mn15–10000

Ti1030–5000

Zn30100–50000

火焰原子吸收分光Ag730–5000

光度法Al2291100–125000

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Au1.55–1000

Cd720–1000

Ce310–200

Cu310–10000

Fe1650–5000

Mg24–400

Mn930–10000

Ti6060–100000

Zn310–1000

Ag0.21–30

Al0.72–100

Au0.10.3–20

Cd0.21–7

Ce//

無火焰原子吸收分

Cu0.31–50

光光度法

Fe515–100

Mg0.030.1–3

Mn0.62–100

Ti6.520–500

Zn1.55–50

注：/表示無合適的參考數值。

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附錄F

（資料性附錄）

推薦用試驗條件記錄表

推薦用試驗條件記錄見表F.1

表F.1試驗條件記錄表

試驗條件記錄表

試驗名稱試驗單位

試驗地點試驗日期

試驗流程簡介

受試材料及受

試生物處理

四膜蟲培養(yǎng)基pH溫度培養(yǎng)容器接種密度接種體積

培養(yǎng)條件

容器四膜蟲吸收時間排出時間取樣時間

平行數

試驗設計規(guī)格接種密度監(jiān)測監(jiān)測頻率

受試培養(yǎng)基儲儲備液試驗暴露受試培養(yǎng)基特性

稀釋溶液

備液及試驗暴濃度濃度（pH、穩(wěn)定性等）

露濃度

四膜蟲鏡檢細吸收速率排出速率生物富集相關參數

四膜蟲暴露及

密度胞狀態(tài)常數常數系數計算方法

參數計算

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附錄G

（資料性附錄）

推薦用金屬納米材料生物富集等級劃分表

推薦用金屬納米材料生物富集等級劃分表見表G.