T-HBIQA 0003.3-2024 食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法 第3部分：沙丁魚實(shí)時(shí)熒光PCR法

T/HBIQAT/HBIQA0003.3—2024食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法DetectionofcommonHistamine-richfishderivedingredientinfoodPart3:SardinapilchardusReal-timePCRmethod2024-08-15發(fā)布2024-10-15實(shí)施河北省檢驗(yàn)檢疫學(xué)會(huì)發(fā)布22規(guī)范性引用文件GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分3.1沙丁魚Sardinapilchardus3.2實(shí)時(shí)熒光PCRreal-3.3Ct值cyclethreshol4.1PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）4.2DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）4.3Cytb：線粒體細(xì)胞色素b基因（Cytochromeb4.4dNTP：脫氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphat4.5CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrithylammoniumbromide）4.6Tris：三（羥甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethan4.7EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic4.8FAM：羧基熒光素（carboxyfluorescei提取樣品DNA為模板，以沙丁魚Cytb基因中相對(duì)保守且高度特異的引物和探針進(jìn)行目標(biāo)物的實(shí)時(shí)熒光3真核生物P:FAM-ATTTCGGATCACTCCTGGGCCTATGCT-B），），6.9熒光PCR預(yù)混液（2×)。8檢驗(yàn)步驟4上清液至另一新離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，混勻后室溫下靜置1h。12000r/min離心10備用。也可用等效的商業(yè)化DNA提取試劑盒提取樣品DNA。取適量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別測定260nm和28c=A260×N×50··························（1）c——DNA濃度，單位為微克每微升(μg/μLN——核酸稀釋倍數(shù)。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見表2。每個(gè)樣品各做兩個(gè)平行管，可先將反應(yīng)試劑及引物預(yù)混成混合液。表2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系終濃度反應(yīng)體系/μLF(10μmol/L)1R(10μmol/L)1P(10μmol/L)1DNA模板(50-100ng/μL)— ），檢驗(yàn)過程中分別設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。以沙丁魚提取的DNA為陽性對(duì)照，以已知不含有沙丁魚的樣品提取的DNA為陰性對(duì)照，以滅菌水為空白對(duì)照。樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照各設(shè)置兩個(gè)平行。5c)陽性對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長，且熒光通道出d)內(nèi)參照：被檢樣品有熒光對(duì)數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值＜30.0。a）如Ct值≤35.0，則判定為被檢樣品陽性，擴(kuò)增靶標(biāo)序列參見附錄A；6A.1沙丁魚Cytb基因擴(kuò)增參考序列（Genbank序列號(hào)NC_039555'